Научный журнал
Международный журнал прикладных и фундаментальных исследований

ISSN 1996-3955
ИФ РИНЦ = 0,686

АНАЛИЗ ПРОДУКЦИИ ЭМБРИОНАЛЬНОГО И ПЛОДОВОГО ГЕМОГЛОБИНОВ В РАННЕМ ЭМБРИОГЕНЕЗЕ ЧЕЛОВЕКА

Кривенцев Ю.А. 1 Бисалиева Р.А. 1 Гудинская Н.И. 1 Кривенцева М.Ю. 1 Онищенко М.С. 2
1 ГБОУ ВРО «Астраханский государственный медицинский университет Минздравсоцразвития России»
2 ГБУЗ АО «Патологоанатомическое бюро»
В работе проведено исследование продукции эмбрионального и плодового гемоглобинов в раннем эмбриогенезе человека (в диапазоне гестационного возраста от 4 до 12 недель включительно). Показано, что эмбриональный гемоглобин достигает пика своей концентрации на 5-й неделе гестационного возраста, после чего его уровень неуклонно снижается, достигая минимума к 12-й неделе. Приведенные данные по продукции плодового гемоглобина дают ориентировочные сроки начала синтеза этого белка: 4-5-я недели гестации и свидетельствуют о неуклонном экспоненциальном росте темпа его синтеза в раннем эмбриогенезе человека. Сравнительный анализ динамики концентрации эмбрионального и плодового гемоглобинов в указанном диапазоне гестационного возраста показал высокий уровень обратной корреляции продукции этих протеинов по отношению друг к другу.
эмбриогенез
эмбриональный гемоглобин
плодовый гемоглобин
иммунохимия
тест-система
1. Бахмутова Л.А. Выявление эмбрионального гемоглобина в крови новорожденных с внутриутробной гипоксией / Л.А. Бахмутова, Ю.А. Кривенцев, Л.А. Огуль // Вопросы практической педиатрии. – 2006. – Т. 1, № 4. – С. 12.
2. Безрукавникова Н.В. Стероидсвязывающие белки у больных раком молочной железы / Н.В. Безрукавникова, А.В. Коханов, Ю.А. Кривенцев, Д.М. Никулина, Л.М. Берштейн, В.В. Кутуков // Вопросы онкологии. – 2007. – Т. 53, № 4. – С. 409-413.
3. Бойко О.В. Биохмические и иммунологические маркеры в диагностике патологических состояний / О.В. Бойко, А.Х. Ахминеева, Н.И. Гудинская, В.И. Бойко, Д.М. Козак, В.А. Бендюг // Фундаментальные исследования. – 2013. – № 9-3. – С. 327-329.
4. Бойко В.И. Острофазовые белки в слюне рабочих на предприятии по переработке природного газа и конденсата с высоким содержанием сероводорода / В.И. Бойко, Ю.И. Доценко, О.В. Бойко // Клиническая лабораторная диагностика. – 2011. – № 6. – С. 18-20.
5. Гланц С. Медико-биологическая статистика / С. Гланц. – Пер. с англ. – М.: Практика, 1999. – 459 с.
6. Зайчик А.Ш. Основы патохимии / А.Ш. Зайчик, Л.П. Чурилов. – С.-Пб. «Элби-СПб». – 2000. – 324 с.
7. Иржак Л. И. Гемоглобины и их свойства / Л.И. Иржак. – М. : Наука, 1983. – 150 с.
8. Касьянова Т.Р. Диагностическое значение определения фетального гемоглобина у больных хроническим гепатитом и циррозом печени / Т.Р. Касьянова, Б.Н. Левитан, Ю.А. Кривенцев, Д.М. Никулина // Фундаментальные исследования. – 2011. – № 10-3. – С. 505-508.
9. Токарев Ю.Н. Иммунохимический метод ряда гемоглобинопатий: Методические рекомендации / Ю.Н. Токарев, А.Н. Ахундова, А.П. Андреева. – Баку: Новая книжная типография, 1982. – 9 с.
10. Топунов А.Ф. Гемоглобины: эволюция, распространение и гетерогенность / А.Ф. Топунов, Н.Э. Петрова // Успехи биологической химии. – 2001. – Т. 41. – С. 199-228.

Процесс внутриутробного развития человека является предметом многочисленных исследований, проводимых в области гематологии, эмбриологии, акушерства, педиатрии (в т.ч. неонатологии), анатомии, гистологии, возрастной физиологии, трансплантологии. Такой интерес вызван выявлением и изучением факторов, влияющих на процессы развития плода, и условий, необходимых для рождения здорового ребенка. Одним из таких факторов является стадиоспецифическая гетерогенная система гемоглобина, включающая множество изотипов этого белка, спектр которых претерпевает изменения как в онтогенезе, так и при различных патологических состояниях [6, 7].

Особый интерес для изучения представляют антенатальные типы гемоглобина – эмбриональный (HbP) и плодовый (или фетальный – HbF), являющиеся основными типами гемоглобина во внутриутробном онтогенезе. Динамика их продукции на данном этапе развития изучена недостаточно. Одним из свойств этих белков является повышенное сродство к кислороду, что позволяет в условиях относительной внутриутробной гипоксии обеспечивать адекватное снабжение тканей плода кислородом [3, 4, 7, 10].

В последнее десятилетие отмечается повышение интереса к изучению отдельных изотипов гемоглобина и моделированию помощью иммунохимических тест-систем на эти белки [1, 2, 9]. Неоспоримым преимуществом иммунохимических методик индикации белков является их высокая специфичность и чувствительность. Кроме того, эти методы позволяют исследовать сложные биологические смеси без какой-либо предварительной очистки и выделения исследуемого протеина.

На основании вышеизложенного представляется целесообразным иммунохимическое изучение количественного соотношения эмбрионального и плодового гемоглобинов для пополнения фундаментальных сведений по динамике продукции этих белков в антенатальном онтогенезе человека в норме.

Цель исследования: иммунохимический анализ продукции эмбрионального и плодового гемоглобинов в раннем эмбриогенезе человека.

Материалы и методы исследования

Исходным биоматериалом для анализа служил абортивный материал сроком 4-12 недель, сбор которого проводили только с письменного согласия пациенток. В целях исключения негативного влияния патологических факторов внутриутробного состояния, потенциально способных исказить картину результатов данного исследования, отбор материала осуществляли только по плановым абортам, без сопутствующей патологии, проводимым с целью прерывания незапланированной беременности. В силу известных ограничений клинических показаний к плановым абортам по срокам, сбор материала со сроками гестации: до 4 недель и после 12 недель не проводился.

Материал сразу по прибытии в лабораторию промывали и подвергали сортировке при участии квалифицированных гистологов и биоморфологов. Суть процесса состояла в тщательном отделении тканей эмбриона от материнских и оболочечных тканей. Оставшиеся части взвешивались и подвергались гомогенизации механически-термическим способом. Полученная кашица подвергалась двукратному замораживанию и оттаиванию.

Экстрагирование цитозольных белков проводили добавлением в полученную гомогенную кашицу 0,9 % раствора NaCl в объемном соотношении 1:2. Для избавления от клеточных обломков взвесь центрифугировали при 8000 g в течение 30 мин, после чего осадок отбрасывали.

В ходе сбора и обработки биоматериала было получено 174 образца эмбриональных тканей, совокупность которых была разделена на 9 групп по срокам эмбриогенеза (в неделях гестационного возраста) (табл. 1).

Таблица 1

Выборка эмбрионального материала по срока гестации

Срок (в неделях)

Число индивидуальных

образцов

4

14

5

15

6

18

7

22

8

21

9

26

10

24

11

19

12

15

Всего

174

Для количественной калибровки стандартных проб проводили контроль концентрации HbP и HbF в них следующими способами:

  • Полуколичественное определение концентрации эмбрионального гемоглобина в пробе методом иммунодиффузионного титрования по Оухтерлони, исходя из пороговой чувствительности полученной тест-системы на этот белок (4,23 ± 0,21 мг/л).
  • Оптическое определение количества общего гемоглобина в пробе, определяемое унифицированным гемоглобинцианидным методом при длине волны 540 нм и толщине слоя 1 см против дистиллированной воды на спектрофотометре SPEEKOL-11 (по инструкции, утвержденной руководителем Департамента государственного контроля качества, эффективности, безопасности лекарственных средств и медицинской техники МЗ РФ 17.06.2000);
  • Оптическое определение количества HbF и HbР в очищенных препаратах этих белков, определяемое аналогично.

Специфика работы с подобным биоматериалом состоит в том, что из тканей эмбрионов (4-12 недель) таких малых размеров невозможно получение их крови в чистом виде. Поэтому расчет концентрации исследуемых белков проводили не на единицу объема (мг/л), а на единицу массы исследуемого субстрата (мг/кг), конвертируемые затем для наглядности в относительные массовые доли ( %) от общего гемоглобина. При сравнительном анализе динамики продукции антенатальных гемоглобинов (HbP и HbF) в раннем эмбриогенезе, определение концентрации плодового и эмбрионального гемоглобинов проводили на единицу объема (мг/л).

Для количественного анализа изучаемых белков в биоматериале использовали специфические иммунохимические тест-системы на HbP и HbF, полученные и стандартизированные авторами самостоятельно [1, 8]. Рассчитанный порог чувствительности смоделированной тест-системы на HbP оказался равным 2,18 ± 0,32 мг/л, на HbF – 1,73 ± 0,28 мг/л.

Определение уровня HbP проводили методикой радиальной иммунодиффузии по Манчини в модификации Фехей и Мак-Келви с использованием полученного калибровочного графика.

Количественный анализ плодового гемоглобина проводили самостоятельно разработанным и запатентованным способом ракетного иммуноэлектрофореза с додецилсульфатом натрия [8].

Для оценки статистической значимости результатов исследования использовали лицензионный пакет прикладных программ статистического анализа Excel-2007 (Microsoft) и Statistica 6.0 (Stat Soft, Inc.). Для каждой выборки вычисляли средние величины (М), среднее квадратичное отклонение (σ), средние ошибки средней арифметической (m). С целью определения значимости (р) различий сопоставляемых величин применяли критерий (t) Стьюдента с поправкой Бонферрони и однофакторный дисперсионный анализ с вычислением критерия F Фишера. Различия считали значимыми при р < 0,05. Для оценки межгрупповой зависимости проводили линейный корреляционный анализ Пирсона (коэффициент корреляции – r). Корреляция считалась высокой при приближении модульной величины r к единице [5].

Результаты исследования и их обсуждение

Ниже приводятся данные по продукции и динамики концентрации эмбрионального гемоглобина в раннем эмбриогенезе человека.

Экстраполяция полученных результатов иммунохимического определения HbP показывает (табл. 2), что этот, онтогенетически самый ранний тип гемоглобина, достигает пика своей продукции на 5-й неделе гестационного возраста (ГВ), после чего его уровень неуклонно экспоненциально снижается, достигая минимума к 12-й неделе. Проведенный корреляционный анализ по Пирсону показал высокую обратную зависимость между продукцией эмбрионального гемоглобина и сроком гестации (r = – 0,879) в диапазоне с 4 по 12 неделю.

Иммунохимический количественный анализ HbF в исследуемых образцах по гестационным группам дал следующие результаты (табл. 3).

Приведенные данные дают ориентировочные сроки начала синтеза плодового гемоглобина: 4-5-я недели гестации и свидетельствуют о неуклонном экспоненциальном росте темпа продукции этого белка в раннем эмбриогенезе человека. Дисперсионный анализ свидетельствует о высокой сходимости результатов. Линейный корреляционный анализ Пирсона показал высокую степень прямой зависимости между продукцией фетального гемоглобина и сроком гестации (r = 0,932).

Проведен сравнительный анализ продукции HbF и HbP в раннем эмбриогенезе человека (4-12 недели гестации). Результаты динамики концентрации HbF и HbP в указанном диапазоне ГВ (рисунок) позволили провести анализ корреляции продукции этих протеинов по отношению друг к другу. Линейный анализ Пирсона по данным показателям показал высокий уровень обратной корреляции (r = – 0,94).

Таблица 2

Продукция HbP в раннем эмбриогенезе человека

Срок

(в неделях)

n

Концентрации HbP (мг/кг)

Стандартное отклонение (σ)

4

13

61 ± 2,4

1,76

5

16

74 ± 3,5

2,2

6

19

41 ± 1,9

1,33

7

21

29 ± 1,4

0,93

8

20

22 ± 1,5

1,92

9

27

18 ± 1,3

0,86

10

22

15 ± 0,9

0,63

11

18

12 ± 0,9

0,65

12

14

9 ± 0,4

0,58

Примечание. σ по генеральной совокупности средних концентраций HbP (мг/кг) 0,55. Коэффициент дисперсии (F) = 5,7.

Таблица 3

Динамика продукции фетального гемоглобина в раннем эмбриогенезе человека

Срок

(в неделях)

n

Концентрации HbF (мг/кг)

Стандартное отклонение (σ)

4

13

0,0 ± 0,0

0.0

5

16

4,2 ± 0,21

0,15

6

19

7,2 ± 0,53

0,36

7

21

12,1 ± 0,9

0,63

8

20

13,3 ± 1,2

2,1

9

27

13,5 ± 1,7

1,12

10

22

14,4 ± 1,6

1,22

11

18

15,6 ± 1,7

1,26

12

14

16,5 ± 1,8

1,36

Примечание. σ по генеральной совокупности средних концентраций HbF (мг/кг) 0,174, коэффициент дисперсии (F) = 6,4.

kriv1.wmf

Динамика концентраций эмбрионального и плодового типов гемоглобина в раннем эмбриогенезе человека

Результаты параллельного количественного определения HbP и HbF свидетельствуют о том, что в образцах исследуемого материала оба белка выявлялись в 100 % случаев, начиная уже с 5-й недели гестации (табл. 2 и 3). На четырехнедельном сроке гестации выявляли лишь HbР в высокой концентрации, хотя пика его значения достигали на 5-й неделе ГВ. Иммунохимически зафиксировано первое появление плодового гемоглобина в эмбриональных тканях на 5-ой неделе гестации. Динамика изменений количественных показателей HbР и HbF носила разнонаправленный характер: уровень HbР плавно снижался по ходу эмбрионального развития, составляя на 8-й неделе ГВ всего 12 % от максимального значения, а уровень HbF неуклонно возрастал, превысив к 12 неделям начальные значения в 4 раза (рис. 1). Такое угасание синтеза HbР можно объяснить начинающимися после 5-й недели внутриутробного развития атрофическими процессами в желточном мешке, который является местом синтеза данного белка. Продукция HbF связана с новым этапом в развитии гемопоэза – эмбриональное и фетальное кроветворение стартует с 5-ой недели, продолжаясь до конца гестационного периода и, в отличие от внеэмбрионального, имеет органную локализацию – печень, функционирующую наиболее активно после 12-й недели внутриутробного периода.

Заключение

Показана высокая достоверная зависимость продукции антенатальных гемоглобинов от сроков гестации в раннем эмбриогенезе человека (4-12 недель гестации): для эмбрионального гемоглобина корреляция является высокой отрицательной (r = – 0,88); для плодового – высокой положительной (r = 0,93). Установлены сроки начала продукции эмбрионального гемоглобина: с 4-й недели гестационного возраста, плодового гемоглобина: с 5-й недели.


Библиографическая ссылка

Кривенцев Ю.А., Бисалиева Р.А., Гудинская Н.И., Кривенцева М.Ю., Онищенко М.С. АНАЛИЗ ПРОДУКЦИИ ЭМБРИОНАЛЬНОГО И ПЛОДОВОГО ГЕМОГЛОБИНОВ В РАННЕМ ЭМБРИОГЕНЕЗЕ ЧЕЛОВЕКА // Международный журнал прикладных и фундаментальных исследований. – 2016. – № 8-4. – С. 531-534;
URL: http://applied-research.ru/ru/article/view?id=10118 (дата обращения: 25.03.2019).

Предлагаем вашему вниманию журналы, издающиеся в издательстве «Академия Естествознания»
(Высокий импакт-фактор РИНЦ, тематика журналов охватывает все научные направления)

«Фундаментальные исследования» список ВАК ИФ РИНЦ = 1.252