Научный журнал
Международный журнал прикладных и фундаментальных исследований

ISSN 1996-3955
ИФ РИНЦ = 0,570

АНТИГЕННЫЕ ХАРАКТЕРИСТИКИ ШТАММОВ ОРТОХАНТАВИРУСОВ, ВЫДЕЛЕННЫХ ОТ МЫШЕЙ СЕМЕЙСТВА APODEMUS

Компанец Г.Г. 1 Иунихина О.В. 1 Потт А.Б. 1
1 ФГБНУ «Научно-исследовательский институт эпидемиологии и микробиологии имени Г.П. Сомова»
Цель данного исследования состояла в изучении антигенных характеристик штаммов ортохантавирусов, выделенных в Приморском крае от природных носителей – полевой и восточноазиатской мышей в реакции нейтрализации (РН). Проанализированы антигенные характеристики 10 штаммов, включая 2 выделенных от Apodemus agrairus, 5 штаммов от A. peninsulae и 3 прототипных штамма вирусов Hantaan, Seoul и Puumala. Показаны четкие антигенные различия между штаммами всех исследованных серотипов и возможность их дифференциации с помощью иммунных сывороток к гомологичным и гетерологичным антигенам в указанной серологической реакции. В то же время по антигенным свойствам штаммы, выделенные от восточноазиатской мыши, разделены на три группы: Amur, Hantaan-подобные и штаммы без четкой дифференциации серотипа. Все исследованные штаммы, выделенные от полевой мыши, однозначно отнесены к серотипу Hantaan.
штаммы ортохантавирусов
антигенные свойства
Hantaan
Amur
1. Antigenic and genetic properties of viruses linked to hemorrhagic fever with renal syndrome / Schmaljohn C.S.et al. // Science. – 1985. – Vol. 227. – P. 1041–1044.
2. International Committee on Taxonomy of Viruses (ICTV), 2016 Release, EC 48, Budapest, Hungary, August 2016: [Электронный ресурс]. – URL: https://talk.ictvonline.org/taxonomy/ (дата обращения: 01.08.2017).
3. Слонова Р.А. Современные аспекты природной очаговости хантавирусной инфекции в Приморском крае / Р.А. Слонова, Т.В. Кушнарева, Г.Г. Компанец // Тихоокеанский медицинский журнал. – 2008. – № 2. – С. 5–9.
4. Яшина Л.Н. Генетическое разнообразие хантавирусов в популяции грызунов и насекомоядных азиатской части России: дис. … д-ра биол. наук. – Кольцово, 2012. – 264 с.
5. Serotypic classification of hantaviruses by indirect immunofluorescent antibody and plaque reduction neutralization tests / Lee P.W. et al. // Journal of Clinical Microbiology. – 1985. – Vol. 22, № 6. – P. 940–944.
6. Serological relationships among viruses in the Hantavirus genus, family Bunyaviridae. / Chu Y.K. et al. // Virology. – 1994. – Vol. 198, № 1. – P. 196–204.
7. The first complete genomic characterization of an Amur virus isolate from China / Zhang Y. et al. // Archives of Virology. – 2013. – Vol. 158, № 10. – 2185–2188.
8. Bi Z. Hantavirus infection: a review and global update / Bi Z., Formenty P.B.H., Roth C.E. // Journal of Infections in Developing Countries. – 2008. – Vol. 2, № 1. – P. 3–23.
9. Кушнарева Т.В. Идентификация вирусов Hantaan и Amur и вызываемых ими инфекций в модифицированных тестах торможения гемагглютинации / Т.В. Кушнарева, Г.Г. Компанец // Фундаментальные исследования. – 2014. – № 11–2. – С. 329–334.
10. Tischler N.D. Characterization of cross-reactive and serotypespecific epitopes on the nucleocapsid proteins of hantaviruses // Tischler N.D., Rosemblatt M., Valenzuela P.D. // Virus Researches. – 2008. – Vol. 135. – P. 1–9.
11. A comparative study of hantavirus infection in Japan and Far East Russia / Kariwa H. et al. // Japanese Journal of Veterinary Research. – 2007. – Vol. 54, № 4. – P. 145–161.

Серологическая классификация вирусов традиционно основывается на классических подходах к выявлению антигенных различий. В частности, перекрестное взаимодействие штаммов в разных серологических тестах, наряду с результатами генетического анализа, стало основой выделения вирусов в отдельный род Hantavirus семейства Bunyaviridae [1]. В 2016 г. решением рабочей группы по Bunyaviridae Международного комитета по таксономии вирусов (ICTV) создан новый порядок Bunyavirales, включающий 8 семейств, в том числе Hantaviridae, и предложено новое название рода Orthohantavirus [2]. Согласно новой классификации на территории Приморского края установлена циркуляция по меньшей мере 4 видов ортохантавирусов: Hantaan (включая Amur), Seoul, Puumala (ранее Hokkaido) и Fusong (ранее Vladivostok). До настоящего времени подтверждена роль только первых двух вирусов в этиологии геморрагической лихорадки с почечным синдромом (ГЛПС) [3]. Генетические особенности ортохантавирусов, циркулирующих в нашем регионе, хорошо представлены Л.Н. Яшиной [4], тогда как антигенные характеристики штаммов этих вирусов, выделенных из разных источников – от диких/синантропных грызунов и больных ГЛПС, изучены недостаточно.

Цель данного исследования: изучить антигенные характеристики штаммов ортохантавируса Hantaan, выделенных от мышей Apodemus agrairus и A. peninsulae.

Материалы и методы исследования

В работе использованы штаммы рабочей коллекции лаборатории хантавирусных инфекций НИИ эпидемиологии и микробиологии имени Г.П. Сомова (табл. 1).

Выделение штаммов ортохантавирусов, накопление антигенов для проведения серологических реакций проводили на клеточной культуре Vero E-6, используя стандартные методики, коммерческие реактивы и питательные среды для культивирования клеток.

Для идентификации выделенных изолятов использовали реакцию нейтрализации, основанную на подавлении образования фокусов, которую проводили по методике Lee P.W. и соавт. [5]. Кратко, в равных объемах смешивали двукратные разведения сывороток крови иммунизированных животных (от 1:32 до 1:1024), 50-100 фокусообразующих единиц (ФОЕ) вируса и комплемент (1:100) и инкубировали 1 час при 37 °С, после чего вышеуказанную смесь вносили в дозе 0,2 мл в лунки 24-луночных планшетов с монослоем клеток Vero E6. После контакта в течение часа при 37 °С инокулят сливали, монослой однократно отмывали средой МЕМ и вносили 0,8 мл полужидкого покрытия, состоящего из среды Игла МЭМ, содержащей 0,6 % карбоксиметилцеллюлозы, 2,0 % СЭК, антибиотики. Планшет с инфицированными клетками инкубировали в течение 10–11 дней при 37 °С в термостате с 5 % содержанием CO2. Учет реакции проводили через 8–10 дней. Полужидкое покрытие сливали, клетки промывали один раз (для отмывки использовали 0,85 % раствор NaCl). После чего клетки фиксировали абсолютным спиртом при комнатной температуре по 400 мкл/лунку (15, 20 минут), после удаления фиксатива клетки отмывали 0,85 % раствором NaCl (3х10 минут). Затем вносили специфическую антихантавирусную сыворотку (сыворотка реконвалесцента ГЛПС, исходный титр 1:2048) в разведении 16–32 ед. по 200 мкл/лунку. После инкубации монослой отмывали (3х5 минут) раствором фосфатно-солевого буфера (ФСБ), содержащим 1 % Твин-20, и вносили меченный пероксидазой белок «А» 200 мкл/лунку (исходный титр 1:20000, 8–16 ед., разведение на трис-буфере с 0,05 % раствором Твин-20 и 0,1 % бычьего сывороточного альбумина) на 60 мин. при 37 °С. Затем монослой отмывали 0,85 % раствором NaCl (3х5 минут). Для выявления фокусов в лунки вносили субстрат по 400 мкл (рабочий раствор субстрата: к 8 мл ФСБ добавлены 1 мл раствора 3,3’диаминобензидина, 1 мл 0,6 % раствора NiCl2 и 4 мкл 30 % Н2О2.). Фокусы проявлялись в течение 5–15 минут, после чего панель промывали проточной водой, подсушивали и подсчитывали их количество. Титр вируса выражали в десятичных логарифмах, по количеству фокусов, образованных при внесении 0,2 мл вируссодержащей жидкости в лунку, и выражали в lg/1,0 мл. Титр нейтрализующих антител определяли по разведению сыворотки крови, приведшему к уменьшению количества фокусов на 80 %.

В качестве прототипных использовали штаммы 76–118 вируса Hantaan, Seo 80–39 вируса Seoul и CG 18–20 вируса Puumala. Гипериммунные сыворотки к выделенным и прототипным штаммам ортохантавирусов получали при иммунизации беспородных самцов белых крыс 4-недельного возраста при подкожном введении вируссодержащей жидкости с титром не менее 4,5 lg ФОЕ/1,0 мл, объем введения составлял 0,5 мл. Перед использованием в реакции нейтрализации иммунные сыворотки инактивировали нагреванием на водяной бане при температуре 56 °С в течение 40 мин.

Результаты исследования и их обсуждение

При проведении перекрестной реакции нейтрализации с иммунными сыворотками получены следующие результаты (табл. 2).

Между штаммами, выделенными от полевых мышей из Приморского края (ПМ-10508-89 и ПМ-95) и Южной Кореи (прототипный штамм 76–118 вируса Hantaan), выявлено близкое антигенное родство, разность титров нейтрализующих антител (нАТ) в перекрестных реакциях составляла 0–4.

Штаммы, выделенные от восточноазиатской мыши, характеризовались неоднородной картиной антигенных взаимоотношений. Штамм ВАМ 15-99, первый штамм, выделенный на культуре клеток в Приморском крае, может считаться прототипным штаммом серотипа Amur. Его антигенное отличие от штаммов, выделенных от полевой мыши, подтверждается результатами реакции нейтрализации: разность титров нАТ в иммунной сыворотке, полученной к этому штамму, к гетерологичным антигенам составляет более 4, что соответствует серологическому критерию серотипа хантавируса [1, 6]. Тогда как по разнице титров нАТ к гомологичным и гетерологичным антигенам (≤ 4) штаммы, ВАМ 25-04, ВАМ 26-04 и штамм ВАМ 16-04 имеют родство как к серотипу Hantaan, так и к серотипам Amur и Seoul. Штамм ВАМ 6-04 имеет близкое антигенное родство только с штаммами, выделенными от полевой мыши.

Таблица 1

Сведения о штаммах ортохантавирусов, использованных в исследовании

п/п

Источник выделения штамма

Название штамма в рабочей коллекции

Географическое происхождение

Год выделения

1

Apodemus agrairus

ПМ-79-95

Приморский край, Спасский р-он

1996

2

Apodemus agrairus

ПМ-10508-89

Приморский край, Спасский р-он

1989

3

Apodemus peninsulae

ВАМ 6-04

Приморский край, Надеждинский р-н

2004

4

Apodemus peninsulae

ВАМ-15-99

Приморский край, Надеждинский р-н

2000

5

Apodemus peninsulae

ВАМ-25-04

Приморский край, Надеждинский р-н

2004

6

Apodemus peninsulae

ВАМ-26-04

Приморский край, Надеждинский р-н

2004

7

Apodemus peninsulae

ВАМ-16-04

Приморский край, Надеждинский р-н

2004

8

Apodemus agrairus

76-118

Korea

1976

9

Rattus norvegicus

Seo 80-39

Korea

1980

10

Myodes glareolus

CG 18-20

Россия

1984

 

Таблица 2

Результаты идентификации штаммов ортохантавирусов иммунными сыворотками в реакции нейтрализации

 

Штаммы, выделенные от A. agrairus и A. peninsulae

Прототипные штаммы

Иммунные сыворотки

ПМ

-79-95

ПМ

-10508-89

ВАМ

6-04

ВАМ

-15-99

ВАМ

-25-04

ВАМ

-26-04

ВАМ

-16-04

76-118

Seo 80-39

CG 18-20

ПМ-79-95

512

512

128

< 32

< 32

< 32

< 32

256

< 32

< 32

ПМ-10508-89

256

512

128

< 32

< 32

64

< 32

64

< 32

32

ВАМ 6-04

128

256

256

< 32

< 32

32

32

128

< 32

< 32

ВАМ-15-99

< 32

< 32

< 32

256

64

64

32

< 32

< 32

< 32

ВАМ-25-04

32

32

< 32

64

128

64

64

32

32

< 32

ВАМ-26-04

32

32

< 32

128

64

128

32

< 32

32

< 32

ВАМ-16-04

32

32

< 32

64

32

32

128

32

32

< 32

76-118

256

256

128

< 32

32

32

64

512

< 32

< 32

Seo 80-39

64

64

< 32

64

< 32

32

< 32

< 32

1024

< 32

CG 18-20

< 32

< 32

< 32

< 32

< 32

< 32

< 32

< 32

< 32

128

Примечание. В таблице представлены обратные значения титров антител.

Результаты перекрестных реакций иммунных сывороток, приготовленных к исследованных штаммов и прототипному штамму CG 1820, со всей очевидностью свидетельствуют о том, что все исследованные штаммы ортохантавирусов, выделенные от диких грызунов в Приморском крае, не имели антигенного родства с вирусом Puumala.

Несмотря на длительную историю изучения вирусов, концепция определения вида в вирусологии до конца не разработана. Один из способов видовой дифференциации основан на изучении антигенных характеристик, однако существование постоянного антигенного дрейфа, дающего множество серологических типов одного вируса, уменьшает ценность серологического критерия в определении вида. В каждом случае вопрос об определении видовых границ решается индивидуально, так для хантавирусов был принят следующий критерий: разница титров нейтрализующих антител к гомологичному и гетерологичному антигенам должна превышать 4 [1, 5, 6].

Приморский край является уникальным очагом ортохантавирусной инфекции, в котором циркулирует несколько гено/серотипов ортохантавирусов в популяциях разных резервуарных хозяев, включая три патогенных для человека. Еще в конце прошлого века в работе Р.А. Слоновой и соавт. (1990 г.) на основании результатов исследования 15 штаммов ортохантавирусов, выделенных от больных ГЛПС и разных видов грызунов, в реакции нейтрализации и в непрямом методе флюоресцирующих антител с использованием моноклональных антител (МКА) сделано предположение об антигенном различии ортохантавирусов, выделенных от полевой и восточноазиатской мышей.

Как известно, антигенные и генетические варианты вируса в ряде случаев могут коррелировать, в других случаях – используются как разные подходы к характеристике одного вируса, то есть могут заменять, дополнять друг друга или быть единственной характеристикой вида. Выделение большего количества штаммов от мышей рода Apodemus позволило выявить четкие серологические и генетические различия, соответствующие критерию уникальности, и доказать самостоятельность серо/генотипа Amur [7–10]. Следует отметить, что несмотря на широкий ареал этого вируса, охватывающий Дальний Восток России, Китай и Корею, случаи ГЛПС, связанные с вирусом Amur, до настоящего времени зарегистрированы только на территории Российской Федерации [11].

Более четкие результаты при определении вида вируса дает использование в серологических реакциях МКА и изучение генов и их продуктов путем определения первичной структуры. Это привело к пересмотру классификации хантавирусов в 2016 г. [2], и в настоящее время вид ортохантавирусов Hantan включает геноварианты Hantaan, Amur и Soochong.

Результаты наших исследований свидетельствуют о высоком родстве штаммов, выделенных от полевой мыши, что детерминировано высокой гомологией нуклеотидных и аминокислотных последовательностей РНК ортохантавирусов, принадлежащих к географическому геноварианту Far East вируса Hantaan [4]. Неоднородность антигенных характеристик штаммов, выделенных от восточноазиатской мыши, в частности выделение отдельного серотипа Amur в рамках существующего вида, также может быть обусловлено наличием маркерных аминокислотных замен, характерных только для данного геноварианта [4].

Таким образом, несмотря на высокое генетическое родство ортохантавирусов вида Hantaan, циркулирующих у мышей рода Apodemus, антигенные характеристики штаммов позволяют выделить по меньшей мере два серотипа, связанные с грызунами разных видов.


Библиографическая ссылка

Компанец Г.Г., Иунихина О.В., Потт А.Б. АНТИГЕННЫЕ ХАРАКТЕРИСТИКИ ШТАММОВ ОРТОХАНТАВИРУСОВ, ВЫДЕЛЕННЫХ ОТ МЫШЕЙ СЕМЕЙСТВА APODEMUS // Международный журнал прикладных и фундаментальных исследований. – 2017. – № 12-1. – С. 108-111;
URL: http://applied-research.ru/ru/article/view?id=11973 (дата обращения: 13.12.2019).

Предлагаем вашему вниманию журналы, издающиеся в издательстве «Академия Естествознания»
(Высокий импакт-фактор РИНЦ, тематика журналов охватывает все научные направления)

«Фундаментальные исследования» список ВАК ИФ РИНЦ = 1.074