Научный журнал
Международный журнал прикладных и фундаментальных исследований

ISSN 1996-3955
ИФ РИНЦ = 0,686

ИЗУЧЕНИЕ МОРФОГЕНЕТИЧЕСКОГО ПОТЕНЦИАЛА ОЗИМОГО РАПСА ОТЕЧЕСТВЕННОЙ СЕЛЕКЦИИ В КУЛЬТУРЕ IN VITRO

Чернобровкина М.А. 1 Хватков П.А. 1 Леонтьева А.В. 1 Долгов С.В. 1
1 ФГБНУ «Всероссийский научно-исследовательский институт сельскохозяйственной биотехнологии»
Проведена оптимизация условий индукции каллусогенеза и регенерации побегов озимого рапса сорта Северянин из гипокотилей 14-дневных проростков. Учитывались следующие параметры культивирования растений в условиях in vitro: эффективность стерилизации, обеспечивающая наибольший выход стерильного материала при наименьшей его гибели, влияние типа экспланта и комбинаций регуляторов роста на каллусогенез, пролиферацию и регенерацию растений. Эффективность каллусогенеза составила от 65 до 100 % на всех экспериментальных средах. Наибольшая эффективность пролиферации каллусной культуры отмечена при культивировании эксплантов из нижней части гипокотиля на среде с добавлением 0,1 мг/л альфа-нафтилуксусной кислоты + 2 мг/л бензиладенина, однако определяющим фактором морфогенетического потенциала является эффективность регенерации побегов, а она в этом варианте была низкой (10 %). При культивировании эксплантов на инициирующей среде, содержащей 1 мг/л 2,4-дихлорфеноксиуксусной кислоты, с последующим пассажем на среду с добавлением 4 мг/л бензиладенина + 2 мг/л зеатина эффективность регенерации побегов была максимальной (49,3 %) в варианте с использованием нижней части гипокотиля. Наиболее высокая эффективность регенерации отмечена при культивировании эксплантов на среде с добавлением 0,1 мг/л альфа-нафтилуксусной кислоты и 0,3 мг/л тидиазурона (81,8 %).
озимый рапс
культура тканей in vitro
каллусогенез
регенерация растений
регуляторы роста
1. Cardoza V., Stewart N.C. Brassica biotechnology: progress in cellular and molecular biology // In Vitro Cell. Dev. Biol. Plant. – 2004. – vol. 40, № 6. – Р. 542–551.
2. Ravanfar S.A., Aziz M.A., Rashid A.A., Salim S. In vitro adventitious shoot regeneration from cotyledon explants of Brassica oleracea subsp. italica and Brassica oleracea subsp. capitata using TDZ and NAA // Pak. J. Bot. – 2014. – vol. 46, № 1. – Р. 329–335.
3. Ravanfar S.A., Aziz M.A., Kadir M.A., Rashid A.A., Sirchi M.H.T. Plant regeneration of Brassica oleracea subsp. italica (broccoli) cv Green Marvel as affected by plant growth regulators // African Journal of Biotechnology. – 2009. – vol. 8, № 11. – Р. 2523–2528.
4. Zeynali M. Influence of genotype and plant growth regulator on somatic embryogenesis in rapeseed (Brassica napus L.) // African Journal of Biotechnology. – 2010. – vol.9, № 26. – Р. 4050–4055.
5. Gerszberg A., Hnatuszko-Konk K., Kowalczyk T. In vitro regeneration of eight cultivars of Brassica oleracea var. capitate // In Vitro Cell. Dev. Biol. Plant. – 2015. – vol. 51, № 1. – Р. 80–87.
6. Pavloviс S., Vinterhalter B., Mitiс N., Adzic S., Pavlovic N., Zdravkovic M., Vinterhalter D. In vitro shoot regeneration from seedling explants in Brassica vegetables: red cabbage, broccoli, savoy cabbage and cauliflower // Arch. Biol. Sci. – 2010. – vol. 62. – Р. 337–3456.
7. Burbulis N., Blinstrubiene A., Kupriene R., Jonytiene V., Rugienius R., Staniene G. In vitro regeneration of Brassica napus L. shoots from hypocotyls and stem segments // Zemdirbyste-Agri. – 2009. – vol. 96, № 3. – Р. 176–185.
8. Ivashuta S.I., Mazin V.V. Regeneration of winter rape in vitro for genetic transformation // Russian Journal of Plant Physiology. – 1994. – vol. 41, № 3. – Р. 388–390.
9. Turczynowska A., Siatkowski I., Broda Z. Analysis of genetic components of winter oilseed rape (Brassica napus ssp. oleifera) regeneration ability under in vitro culture // BioTechnologia. – 2015. – vol. 96, № 1. – Р. 30–35.
10. Леонтьева А.В. Изучение условий регенерации in vitro и агробактериальной трансформации озимого рапса при получении растений с повышенной холодостойкостью / Леонтьева А.В., Чернобровкина М.А., Хватков П.А., Долгов С.В. // XV Молодежная научная конференция «Биотехнология в растениеводстве, животноводстве и ветеринарии» (г. Москва, 8 апреля, 2015 г.) – М., 2015. – С. 5–6.
11. Sretenovic-Rajicic T., Ninkovic S., Uzelac B., Vinterhalter B., Vinterhalter D. Effects of plant genotype and bacterial strain on Agrobacterium tumefaciens-mediated transformation of Brassica oleracea L. var. capitate // Russ J. Plant Physiol. – 2007. – vol.54, № 5. – Р. 653–658.
12. Maheshwari P., Selvaraj G., Kovalchuk I. Optimization of Brassica napus (canola) explant regeneration for genetic transformation // Nat. Biotechnol. – 2011. – vol.29, № 1. – Р. 144–155.

Методы селекции направлены на улучшение старых и создание новых сортов культурных растений с более ярко выраженными хозяйственно ценными признаками, такими как высокая урожайность, устойчивость к биотическим и абиотическим стрессам. В этом направлении биотехнология, и в частности генная инженерия, становится «помощником» традиционной селекции, так как позволяет вводить в геном растения чужеродные гены, отвечающие за полезные качества. При использовании методов биоинженерии необходимо проводить исследования морфогенного потенциала и регенерационной способности для каждого нового целевого генотипа растения.

Рапс озимый (Brassica napus) принадлежит к семейству Brassicaceae и является ценным растением, возделываемым для получения масла пищевого или технического назначения.

Растения данного семейства являются довольно хорошо изученными для применения методов биотехнологии. Работы по введению Brassica napus в культуру in vitro начались приблизительно с 70-х годов прошлого века. За это время были изучены различные факторы, влияющие на каллусогенез и регенерацию растений in vitro, такие как возраст, размер и тип экспланта, генотип растения, состав питательной среды, эффект различных экзогенных регуляторов роста [1–5], однако все эти исследования велись с использованием сортов рапса ярового типа [6, 7]. Относительно озимого рапса имеются лишь единичные сообщения [8–10]. Известно, что регенерация растений сильно зависит от специфичности генотипа [11], поэтому необходимо разработать надежный и воспроизводимый протокол регенерации для определенного генотипа или сорта. Целью данной работы являлось изучение морфогенного потенциала и регенерационной способности озимого рапса отечественной селекции, который является перспективным объектом для дальнейшей трансформации и селекции [11, 12].

Материалы и методы исследования

Растительный материал. В качестве объекта исследований был использован сорт озимого рапса (Brassica napus) Северянин отечественной селекции (ФГБНУ «ВНИИ кормов им. В.Р. Вильямса»). Сорт двунулевой, допущен к возделыванию в Центральном и Центрально-Черноземном регионах. В масле практически отсутствует эруковая кислота и глюкозинолаты. Коммерческая ценность данного сорта состоит в высокой семенной и кормовой продуктивности, качестве масла и шрота, устойчивости к основным болезням, технологичности возделывания и уборки, высокой зимостойкости относительно других сортов озимого рапса отечественной селекции.

Питательные среды. Для проращивания семян в стерильных условиях использовали агаризованную среду Мурасиге – Скуга (MS), содержащую половинную концентрацию макросолей. Для изучения регенерационной способности растений озимого рапса использовали среду MS с добавлением микроэлементов, витаминов и регуляторов роста в различных концентрациях и комбинациях в шести вариантах, подобранных согласно данным литературных источников.

Получение донорных растений в асептических условиях. Для получения растительного материала использовали стерильные донорные растения, полученные в асептических условиях. Для этого первоначально отбирали наиболее крупные семена рапса, затем их стерилизовали в водном растворе коммерческого препарата «Белизна» различной концентрации (от 15 до 50 %) и временной экспозиции (от 10 до 35 минут). После этого семена пятикратно промывали дистиллированной водой. Семена в количестве 25 штук помещали в стерильные культуральные емкости, заполненные средой MS, не содержащей экзогенных регуляторов роста, и культивировали при температуре 23–25 °С, интенсивности освещения 65 mol m-2 s-1 и фотопериоде 16/8 часов (день/ночь) в световом модуле Лаборатории генной инженерии растений ВНИИСБ.

Подготовка эксплантов и их культивирование. При достижении донорными растениями 12–14-дневного возраста их подвергали сегментированию в асептических условиях. В экспериментах по регенерации в качестве эксплантов использовали сегменты длиной около 7 мм из верхней, средней и нижней частей гипокотиля, которые помещали на чашки Петри диаметром 90 мм, заполненные 20–25 мл агаризованной питательной среды MS с добавлением регуляторов роста в различных комбинациях. На одну чашку Петри располагали 15 штук эксплантов, эксперименты проводили в трехкратной повторности для каждого варианта.

Каллусогенез и регенерация. В экспериментах по индукции каллусогенеза использовали 6 вариантов состава питательных сред, различающихся по содержанию фитогормонов и регуляторов роста.

Для роста образовавшихся побегов использовали среду MS, содержащую регуляторы роста в пониженных концентрациях. Каждые 3 недели экспланты пассировали на свежие среды.

В экспериментах были использованы следующие концентрации и комбинации регуляторов роста:

1. 1 мг/л 2,4-Д (первый пассаж), далее 4 мг/л 6-БАП + 2 мг/л Зеатин.

2. 1 мг/л 2,4-Д + 1 мг/л 6-БАП (первый пассаж), далее 1 мг/л 6-БАП.

3. 0,1 мг/л НУК + 1 мг/л 6-БАП (первый пассаж), далее 0,1 мг/л НУК + 1 мг/л 6-БАП.

4. 0,1 мг/л НУК + 2 мг/л 6-БАП (первый пассаж), далее 0,1 мг/л НУК + 2 мг/л 6-БАП.

5. 0,05 мг/л НУК + 0,3 мг/л ТДЗ (первый пассаж), далее 0,3 мг/л ТДЗ + 0,1 мг/л НУК.

6. 0,05 мг/л НУК + 0,1 мг/л ТДЗ (первый пассаж), далее 0,1 мг/л ТДЗ + 0,1 мг/л НУК.

В ходе эксперимента учитывали три показателя эффективности влияния регуляторов роста на процессы морфогенеза у эксплантов:

1. Эффективность каллусогенеза (выражали в процентах путем деления количества эксплантов, образовавших каллус, на общее количество эксплантов в каждом варианте).

2. Интенсивность пролиферации эксплантов (выражали кратностью увеличения объема экспланта путем деления начального объема сегмента гипокотиля на объем образовавшегося каллуса в каждом варианте).

3. Эффективность регенерации из эксплантов (выражали в процентах путем деления количества эксплантов, образовавших побеги, на общее количество эксплантов в каждом варианте).

Статистическую обработку данных проводили с помощью дисперсионного анализа с последующим множественным сравнением частных средних и оценки их по критерию Дункана.

Результаты исследования и их обсуждение

Для получения донорных растений при последующей работе в условиях in vitro необходимо разработать методику эффективной стерилизации, обеспечивающую наибольший выход стерильного материала при наименьшей его гибели. Наибольший выход стерильного материала при наименьшей гибели растений был достигнут при выдерживании семян в 25 % водном растворе коммерческого препарата «Белизна» в течение 20 минут. При менее длительной экспозиции наблюдалось бактериальное и грибное заражение проростков. При более длительной экспозиции наблюдался значительный процент гибели растительного материала.

Известно, что тип экспланта и экзогенные регуляторы роста оказывают большое воздействие на частоту регенерации при использовании различных методов культивирования тканей. Для исследования морфогенного потенциала генотипа и разработки системы эффективной и стабильной регенерации целых растений было изучено влияние типа экспланта и комбинаций регуляторов роста на каллусогенез, пролиферацию и регенерацию растений. Комбинации регуляторов роста были подобраны согласно литературным источникам.

chern1a.tif chern1b.tif chern1c.tif

А Б В

Рис. 1. Каллусогенез у гипокотилей рапса при использовании различных регуляторов роста: А – НУК + 6-БАП (вар. 4), Б – НУК + ТДЗ (вар. 5), В – 2,4-Д (вар. 1)

Таблица 1

Влияние различных комбинаций регуляторов роста на каллусогенез, интенсивность пролиферации и эффективность регенерации озимого рапса

Сегмент гипокотиля

Показатель

Вариант состава среды

Средние

1

2

3

4

5

6

 

Верхний

Каллусогенез ( %)

96

100

100

65

100

100

93,5

Интенсивность пролиферации (раз)

92,67ab

168,99ijk

148,19ghi

123,03cdefg

167,84hijk

112,07bcd

133,78

Регенерация ( %)

22,00abcd

0

18,00abc

0

32,00bcd

7,00ab

13,17

Средний

Каллусогенез ( %)

98

99

97

80

100

100

95,67

Интенсивность пролиферации (раз)

104,09abc

140,32ghi

139,79fg

143,36ghi

146,30ghi

102,56abc

130,4

Регенерация ( %)

40,00cd

0

2,33a

0

0

1,75a

7,48

Нижний

Каллусогенез ( %)

100

99

97

80

99

100

95,83

Интенсивность пролиферации (раз)

85,11a

137,11efg

132,79defg

180,97k

176,28jk

110,60abcd

131,81

Регенерация ( %)

49,33d

2,00a

0

10,00ab

0

0

10,22

Средние

По каллусогенезу ( %)

98

99,33

98

75

99,67

100

 

По интенсивности пролиферации (раз)

94,37a

148,13c

139,67bc

149,12c

156,56c

104,11a

По регенерации ( %)

37,43b

2,71a

11,30a

6,15a

11,48a

7,65a

Примечание. (a-k) – достоверно различающиеся кластеры данных согласно оценке множественных средних по критерию Дункана.

Для двудольных растений и, в частности, семейства Brassicaceae наиболее эффективным регулятором роста для образования каллуса являются цитокинины, преимущественное использование имеет бензиладенин. Регулятор роста тидиазурон (замещенная фенилмочевина (N-фенил N’-1,2,3-тиадиазол-5-илмочевина) не относится к цитокининам, но по характеру воздействия на процессы каллусообразования схож с таковыми. Такой регулятор роста, как 2,4-Д, относится к ауксиновому типу и используется для инициации каллусогенеза у однодольных растений, однако есть сведения, что он может быть в некоторых случаях применен и для двудольных растений [1].

Для инициации каллусообразования в наших исследованиях были использованы цитокинины (бензиладенин 6-БАП), ауксины [2,4-Д, альфа-нафтилуксусная кислота (НУК)], а также тидиазурон (ТДЗ).

Эффективность каллусогенеза составляла порядка 100 % во всех вариантах проведенных нами опытов. Наиболее высокая пролиферативная активность, согласно анализу частных средних, была отмечена на среде, содержащей 0,1 мг/л НУК в сочетании с 1 мг/л 6-БАП (рис. 1, А), а по общим – в варианте сочетания ТДЗ и НУК в концентрациях 0,3 мг/л и 0,1 мг/л (рис. 1, Б, табл. 1).

Использование 1 мг/л 2,4-Д в первом пассаже с последующей пересадкой на среду, содержащую 4 мг/л 6-БАП + 2 мг/л зеатина, обеспечило наиболее высокий процент регенерации побегов (49,3 %) при использовании эксплантов из нижней части гипокотиля (рис. 2, В). Несколько меньшая регенерационная способность наблюдалась в варианте с использованием верхней части гипокотиля при добавлении ТДЗ в концентрации 0,3 мг/л (табл. 1). Однако, согласно литературным данным, использование ТДЗ значительно повышает регенерационную способность эксплантов, в связи с этим было осуществлено более детальное изучение влияния различных концентраций ТДЗ (в сочетании с 0,1 мг/л НУК) на регенерацию рапса (табл. 2). В данном исследовании использовали среднюю часть гипокотиля.

chern2a.tif chern2b.tif chern2c.tif

А Б В

Рис. 2. Образование побегов рапса из каллусов при использовании различных регуляторов роста: А – НУК + 6-БАП (вар. 4), Б – НУК + ТДЗ (вар. 3), В – 2,4-Д (вар. 1)

Таблица 2

Влияние различных концентраций тидиазурона на регенерацию озимого рапса

Концентрация ТДЗ, мг/л

Эффективность регенерации, %

0,15

33,9bc

0,3

81,8d

0,45

63,9cd

0,6

23,2ab

0,75

3,3a

Примечание. (a-d) – достоверно различающиеся кластеры данных согласно оценке множественных средних по критерию Дункана.

Анализ данных, приведенных в табл. 2, свидетельствует о том, что наиболее высокую регенерационную способность (81,8 %) продемонстрировали экспланты, культивируемые на среде с добавлением 0,3 мг/л ТДЗ и 0,1 мг/л НУК. Регенерация растений в данном варианте практически в 2 раза превысила таковую при использовании первого варианта.

Заключение

Анализ морфогенетического потенциала озимого рапса сорта Северянин показал, что эффективность каллусогенеза при использовании эксплантов, полученных от гипокотилей 14-дневных проростков в культуре in vitro, составляет от 65 до 100 % на всех экспериментальных средах, изученных в процессе исследования. Наибольшая интенсивность пролиферации каллусной культуры отмечена при культивировании эксплантов из нижней части гипокотиля на среде с добавлением 0,1 мг/л НУК + 2 мг/л 6-БАП, однако определяющим фактором морфогенетического потенциала является эффективность регенерации побегов, а она в этом варианте была низкой (10 %). При культивировании эксплантов на инициирующей среде, содержащей 1 мг/л 2,4-Д, с последующим пассажем на среду с добавлением 4 мг/л 6-БАП + 2 мг/л зеатина эффективность регенерации побегов была максимальной и в варианте с использованием нижней части гипокотиля составила 49,3 %. Наиболее высокая эффективность регенерации отмечена при культивировании эксплантов на среде с добавлением 0,1 мг/л НУК и 0,3 мг/л ТДЗ (81,8 %).

Исследования проведены в рамках выполнения ГЗ (0574-2014-0024) № госрегистрации АААА-А17-117082950004-9.


Библиографическая ссылка

Чернобровкина М.А., Хватков П.А., Леонтьева А.В., Долгов С.В. ИЗУЧЕНИЕ МОРФОГЕНЕТИЧЕСКОГО ПОТЕНЦИАЛА ОЗИМОГО РАПСА ОТЕЧЕСТВЕННОЙ СЕЛЕКЦИИ В КУЛЬТУРЕ IN VITRO // Международный журнал прикладных и фундаментальных исследований. – 2017. – № 11-2. – С. 260-264;
URL: http://applied-research.ru/ru/article/view?id=12010 (дата обращения: 24.05.2019).

Предлагаем вашему вниманию журналы, издающиеся в издательстве «Академия Естествознания»
(Высокий импакт-фактор РИНЦ, тематика журналов охватывает все научные направления)

«Фундаментальные исследования» список ВАК ИФ РИНЦ = 1.252