Научный журнал
Международный журнал прикладных и фундаментальных исследований

ISSN 1996-3955
ИФ РИНЦ = 0,686

ИССЛЕДОВАНИЕ ЭКСПРЕССИИ БЕЛКОВ-РЕГУЛЯТОРОВ АПОПТОЗА BAD И BCL-2 МНОГОЯДЕРНЫМИ ПЕРИТОНЕАЛЬНЫМИ МАКРОФАГАМИ БЦЖ-ИНФИЦИРОВАННЫХ МЫШЕЙ

Ильин Д.А. 1
1 НИИ Экспериментальной и клинической медицины ФИЦ ФТМ
В популяциях одноядерных и многоядерных макрофагов в первичных культурах перитонеальных клеток интактных и БЦЖ-инфицированных мышей линии BALB/c проводили изучение особенностей экспрессии белков-регуляторов, обладающих проапоптогенным (Bad) и антиапоптотическим (Bcl-2) эффектом. В культурах перитонеальных клеток контрольной и экспериментальных групп многоядерные макрофаги обладали различиями в степени интенсивности экспрессии апоптотических и антиапоптотических факторов по сравнению с одноядерными. В культурах экспериментальных групп макрофаги имели различия в экспрессии апоптотических и антиапоптотических факторов по сравнению с контролем. Снижение численности бинуклеарных и многоядерных макрофагов с признаками экспрессии белка Bcl-2 отмечалось на 3-месячный срок наблюдения. На этот же срок наблюдения возрастало количество экспрессирующих белок Bad многоядерных макрофагов. Полученные данные свидетельствуют об особенностях динамики регуляции апоптоза у субпопуляций макрофагов, разнящихся по классам ядерности, в условиях БЦЖ-инфицированности. Кроме того, были описаны различные варианты локализации белков Bad и Bcl-2 в цитоплазме макрофагов, которые были обусловлены спецификой реализации внутриклеточных процессов, протекающих в цитоплазме этих клеток. Данные особенности следует учитывать при проведении цитологического анализа клеточных культур, содержащих разнящиеся по классам ядерности макрофаги.
многоядерные макрофаги
апоптоз
белки Bad и Bcl-2
1. Исследование in vitro экспрессии ИЛ-1, ГМ-КСФ и ФНО- многоядерными макрофагами БЦЖ-инфицированных мышей / Д.А. Ильин [и др.] // Бюл. экспер. биол. мед. – 2013. – Т. 155. – № 5. – С. 615–618.
2. Исследование in vitro цитофизиологических характеристик многоядерных макрофагов от интактных и БЦЖ-инфицированных мышей / Д.А. Ильин [и др.] // Бюл. экспер. биол. мед. – 2015. – Т. 160. – № 11. – С. 617–621.
3. Шкурупий В.А. Туберкулезный гранулематоз. Цитофизиология и адресная терапия / В.А. Шкурупий. – М.: Изд-во РАМН, 2007. – 536 с.
4. Ильин Д.А. Многоядерные макрофаги / Д.А. Ильин. – Новосибирск: Наука, 2011. – 56 с.
5. Brodbeck W.G., Shive M.S., Colton E., Ziats N.P., Anderson J.M. Interleukin-4 inhibits tumor necrosis factor-alpha-induced and spontaneous apoptosis of biomaterial-adherent macrophages // J. Lab. Clin. Med. – 2002. – Vol. 139. – № 2. – Р. 90–100.
6. Kilari B.P., Kotakadi V.S., Penchalaneni J. Anti-proliferative and Apoptotic Effects of Basella rubra (L.) Against 1, 2-Dimethyl Hydrazine-induced Colon Carcinogenesis in Rats // Asian Pac. J. Cancer Prev. – 2016. – Vol. 17. – № 1. – P. 73–80.
7. Rana S.V. Metals and apoptosis: recent developments // J. Trace. Elem. Med. Biol. – 2008. – Vol. 22. – № 4. – P. 262–284.
8. Flad H.D., Grage-Griebenow E., Petersen F., Scheuerer B., Brandt E., Baran J., Pryjma J., Ernst M. The role of cytokines in monocyte apoptosis // Pathobiology. – 1999. – Vol. 67. – № 5–6. – Р. 291–293.
9. Mootoo A., Stylianou E., Arias M.A., Reljic R. TNF-alpha in tuberculosis: a cytokine with a split personality // Inflamm. Allergy Drug Targets. – 2009. – Vol. 8. – № 1. – P. 53–62.
10. Ray J.C., Flynn J.L., Kirschner D.E. Synergy between individual TNF-dependent functions determines granuloma performance for controlling Mycobacterium tuberculosis infection // J. Immunol. – 2009. – Vol. 182. – № 6. – P. 3706–3717.
11. Saeedi Borujeni M.J., Hami J., Haghir H., Rastin M., Sazegar G. Evaluation of Bax and Bcl-2 Proteins Expression in the Rat Hippocampus due to Childhood Febrile Seizure // Iran J. Child. Neurol. – 2016. – Vol. 10. – № 1. – P. 53–60.
12. Reed J.C. Mechanisms of Bcl-2 family protein function and dysfunction in health and disease // Behring Inst. Mitt. – 1996. – № 97. – P. 72–100.
13. Zhang H., Xiong Z., Wang J., Zhang S., Lei L., Yang L., Zhang Z. Glucagon-like peptide-1 protects cardiomyocytes from advanced oxidation protein product-induced apoptosis via the PI3K/Akt/Bad signaling pathway // Mol. Med. Rep. – 2016. – Vol. 13. – № 2. – P. 1593–1601.

Известно, что многоядерные клетки макрофагального происхождения участвуют в формировании гранулем [1; 2], имеющих значение в патогенезе туберкулезного гранулематоза [3]. Изучены различные аспекты образования гранулем при туберкулезном гранулематозе [3] и обсуждаются проблемы формирования [1; 4] и функционирования многоядерных макрофагальных производных [2; 4]. В то же время не вызывает сомнения тот факт, что численный состав популяции многоядерных макрофагов (МФ) обусловлен интенсивностью процессов формирования [1] и апоптоза данных клеток [2]. В этой связи изучение проблемы апоптоза многоядерных МФ [2] представляет интерес в том плане, что с апоптозом связан механизм элиминации многоядерных клеток в очаге хронического воспаления [5] и это детерминирует изменение клеточного состава последнего.

Описана также динамика изменения клеточного состава БЦЖ-гранулем в процессе развития хронического гранулематозного воспаления [3]. Однако по-прежнему к категории малоизученных вопросов относится динамика реализации апоптоза многоядерных МФ в зависимости от характера влияния проапоптогенных и антиапоптотических факторов, в том числе экспрессируемых самими многоядерными МФ, что обусловливает особенности развития процесса хронического воспаления при туберкулезном гранулематозе.

Далее следует указать, что кроме маркеров апоптоза, какими являются Caspasa-3 и белок p53 [6], экспрессия которых, несомненно, свидетельствует об его индукции [7], небезынтересна роль цитокинов в реализации процесса апоптоза [5; 8]. В частности, следует заметить, что TNF-α индуцирует процесс апоптоза МФ, в то время как IL-4 подавляет их апоптоз [5]. При этом TNF-α обладает весьма сложными функциями и его роль во многом остается малоизученной [9], однако показано его участие в регуляции апоптоза [10].

В то время как учет экспрессии белка Bcl-2 информативен в качестве метода оценки степени ингибирования апоптоза [7], поскольку Bcl-2 является антиапоптотическим фактором [11]. Изучение механизмов действия белков семейства Bcl-2 способствует пониманию их функций в регуляции процесса апоптоза [12]. Существует также Bcl-2-ассоциированный промоутер клеточной гибели белок Bad [13]. При этом известно, что наряду с белком Bad [12] некоторые другие протеины, в частности Bax [11; 12], Bak и Bik, относятся к промоутерам апоптоза [12]. Тем не менее именно белок Bad, причисляемый к Bcl-2-ассоциированным промоутерам клеточной гибели [13], заслуживает наибольшего внимания в плане совместной оценки интенсивности его экспрессии с протеином Bcl-2, детектирование которого, как уже было отмечено, информативно при определении степени ингибирования апоптоза [7].

В связи с вышеизложенным представляется целесообразным изучение аспектов реализации апоптоза многоядерных МФ, имеющих значение в развитии хронического туберкулезного гранулематозного воспаления, и уточнение роли многоядерных макрофагальных производных в экспрессии проапоптогенных и антиапоптотических факторов, обусловливающих степень интенсивности процесса апоптоза МФ, что определяет клеточный состав гранулем.

Целью работы являлось изучение в популяциях одноядерных и многоядерных МФ в первичных культурах перитонеальных клеток (ПК) интактных и БЦЖ-инфицированных мышей динамики экспрессии проапоптогенных (Bad) и антиапоптотических (Bcl-2) белков-регуляторов, обусловливающих специфику реализации апоптоза.

Материалы и методы исследования

Эксперименты проводили in vitro на клетках перитонеального транссудата мышей-самцов линии BALB/c возрастом 2 месяца. При реализации исследования использовали контрольную группу культур ПК, выделенных от интактных животных, и опытные группы культур ПК, выделенных от животных инфицированных микобактериями вакцины БЦЖ (МБ БЦЖ). Выведение животных из эксперимента осуществляли через 1 и 3 месяца после введения им вакцины БЦЖ. Причем на 3-месячный срок наблюдения отмечается формирование типичных БЦЖ-гранулем [3]. Вакцину БЦЖ вводили внутрибрюшинно в дозе 0,5 мг в 0,25 мл изотонического водного раствора NaCl.

Суспензию ПК получали после выведения животных из эксперимента методом дислокации шейных позвонков под эфирным наркозом. Инкубацию культур ПК (106 клеток в 2 мл среды 199, содержащей 10 % сыворотки крови эмбрионов коров) проводили на покровных стеклах в течение 48 часов в пластиковых планшетах для культуральных исследований. Культуры ПК фиксировали 4 % водным раствором формальдегида, приготовленным на фосфатном буфере.

При использовании методов световой микроскопии в культурах ПК оценивали частоту встречаемости клеток в субпопуляциях одноядерных, бинуклеарных и содержащих 3 и более ядер перитонеальных МФ. Цитологический анализ клеточных культур осуществляли при увеличении в 400 раз, используя микроскоп «Axiostar Plus» («Zeiss»). Поскольку (сообразуясь с целью настоящего исследования) была необходима оценка экспрессии проапоптотических и антиапоптотических белков, учитывали численный состав субпопуляций, разнящихся по классам ядерности МФ, экспрессирующих соответствующие факторы. В ходе реализации иммуноцитохимических исследований определяли экспрессию у МФ проапоптогенных (Bad) и антиапоптотических (Bcl-2) белков-регуляторов непрямым иммуноцитохимическим методом с использованием системы визуализации на основе биотин-стрептавидин-пероксидазного комплекса «BD Pharmingen» Anti-Rat Ig HRP Detection Kit и диагностических наборов моноклональных антител «Novocastra». Проводили демаскировку исследуемых факторов 0,3 % раствором Тритона Х-100, приготовленным на фосфатном буфере. Иммуноцитохимическими признаками экспрессии у МФ белков Bad и Bcl-2 считали наличие окраски цитоплазмы в светло-коричневый цвет. При этом определяли долю МФ с указанными классами ядерности, обладающих признаками экспрессии отмеченных факторов.

При статистической обработке результатов анализа проводили оценку вероятности достоверности различий между сравниваемыми средними величинами при учете непараметрического критерия Манна – Уитни с использованием компьютерной программы «Statistica 8». Данные были представлены в виде средней арифметической и ее стандартной ошибки (M ± m). При этом различия между сравниваемыми средними величинами считали достоверными при p < 0,05.

Результаты исследования и их обсуждение

Согласно результатам проведенного исследования в интактных культурах ПК численность одноядерных МФ с признаками экспрессии белков Bcl-2 и Bad составляла около 1 %, тогда как у бинуклеарных и собственно многоядерных МФ экспрессия указанных факторов практически отсутствовала (табл. 1).

Таблица 1

Доля МФ ( %), экспрессирующих Bcl-2 и Bad, в культурах ПК мышей линии BALB/c (M ± m)

Число ядер МФ

Срок после введения БЦЖ

Контроль

1 месяц

3 месяца

Исследуемый фактор

Исследуемый фактор

Исследуемый фактор

Bcl-2

Bad

Bcl-2

Bad

Bcl-2

Bad

1

1,0 ± 0,1

1,0 ± 0,2

57,8 ± 3,4*

38,0 ± 3,7*

25,5 ± 3,0*-

41,8 ± 4,8*

2

0

0

55,6 ± 5,7*

52,9 ± 3,1*

20,0 ± 2,0*-

78,1 ± 3,4*-

3 и более

0

0

76,9 ± 8,0*

58,3 ± 6,0*

44,0 ± 4,0*-

89,5 ± 9,0*?

Примечания: все группы включали одинаковое количество (n = 6) образцов культур ПК; *p < 0,05 по сравнению с контролем; -p < 0,05 по сравнению со сроком наблюдения 1 мес.

В культурах ПК экспериментальных групп динамика изменения показателя численности МФ, принадлежащих ко всем учитываемым классам ядерности, экспрессирующих антиапоптотический белок-регулятор Bcl-2, определялась снижением уровня данного параметра относительно месячного срока в культурах ПК, выделенных от животных, выведенных из эксперимента через 3 мес. от начала последнего, при этом максимальная частота встречаемости клеток с экспрессией фактора Bcl-2 была зарегистрирована в субпопуляции многоядерных МФ на сроки наблюдения 1 и 3 месяца (табл. 1).

Динамика изменения частоты встречаемости МФ с признаками экспрессии апоптотического фактора Bad характеризовалась тем, что количество бинуклеарных и многоядерных МФ, экспрессирующих Bad, относительно месячного срока возрастало на 3 мес. наблюдения (табл. 1). Кроме того, на указанный срок наблюдения численность бинуклеарных и многоядерных МФ с экспрессией апоптотического фактора Bad значительно превышала количество клеток, экспрессирующих антиапоптотический белок-регулятор Bcl-2 (табл. 1).

Необходимо также отметить, что изменения уровней показателя численности МФ определялись прогрессивным увеличением частоты встречаемости их бинуклеарных и многоядерных форм в культурах ПК экспериментальных групп по сравнению с контролем, причем количество МФ, содержащих 3 и более ядер, увеличивалось в большей степени, чем численность бинуклеарных форм относительно контрольного уровня данных параметров (табл. 2).

Таблица 2

Доля бинуклеарных и многоядерных МФ ( %) в культурах ПК мышей линии BALB/c (M ± m)

Число ядер МФ

Срок после введения БЦЖ

Контроль

1 месяц

3 месяца

2

4,2 ± 0,4

5,3 ± 0,5

6,4 ± 0,5*

3 и более

0,8 ± 0,4

1,3 ± 0,5

2,4 ± 0,5*

Примечания: все группы включали одинаковое количество (n = 6) образцов культур ПК; *p < 0,05 по сравнению с контролем.

Отмечаемое возрастание относительной численности бинуклеарных и собственно многоядерных МФ свидетельствовало о положительной динамике образования этих клеточных форм в условиях БЦЖ-инфицированности. Характер изменения величин показателей частоты встречаемости бинуклеарных и многоядерных МФ в культурах ПК экспериментальных групп определялся степенью напряженности процессов формирования и апоптоза макрофагальных производных.

Это согласуется с фактами, указывающими на роль процессов мультинуклеации в формировании многоядерных МФ, реализующихся посредством амитотического деления ядер и клеточного слияния [4]. В этой связи хотелось бы уточнить, что роль амитотического деления ядер, весьма значимая в процессе мультинуклеации МФ в интактных клеточных культурах, существенно уступает таковой в культурах клеток, выделенных от БЦЖ-инфицированных животных. В последнем случае первостепенное значение в формировании многоядерных МФ играет процесс клеточного слияния.

Из вышеизложенного следует, что бинуклеарные и многоядерные МФ имели большую интенсивность индукции процесса апоптоза по сравнению с одноядерными МФ в культурах ПК на все сроки ведения эксперимента. При этом в культурах ПК экспериментальных групп отмечалось изменение численности МФ, принадлежащих ко всем учитываемым классам ядерности, обладающих признаками экспрессии апоптотических и антиапоптотических факторов, степень резистентности к которым у МФ, вероятно, обусловлена их классом ядерности, детерминирующим структурно-функциональные особенности клеток. При этом снижение численности МФ, разнящихся по классам ядерности, с признаками экспрессии антиапоптотического фактора Bcl-2 и значительное возрастание количества экспрессирующих Bad бинуклеарных и многоядерных МФ регистрируется на 3-месячный срок наблюдения.

В то же время следует отметить, что процесс регуляции апоптоза МФ основан не только на действии белков-регуляторов Bad и Bcl-2, но также других факторов, включая некоторые цитокины. Кроме того, контроль численного состава субпопуляций МФ, разнящихся по классам ядерности, осуществляется как вследствие апоптоза этих клеток, так и в результате реакций мультинуклеации и, прежде всего, процессов клеточного слияния, обусловливающих формирование бинуклеарных и многоядерных МФ.

В частности, TNF-α является цитокином, инициирующим фузию МФ, детерминирующую формирование макрофагальных полинуклеаров, и индуцирующим апоптоз этих клеток. Тогда как IL-4 индуцирует реакции клеточного слияния МФ и ингибирует их апоптоз. При этом, на наш взгляд, стоит особо подчеркнуть, что TNF-α и IL-4 имеют значение именно в регуляции противоположно направленных по своей сущности процессов мультинуклеации и апоптоза МФ, обусловливающих количественный состав их субпопуляций. Немаловажно также, что некоторые другие факторы, в частности GM-CSF, который обладает регуляторной функцией в отношении реакций клеточного слияния, определяющего процессы мультинуклеации МФ, также играют роль в контроле численности субпопуляции многоядерных МФ.

Кроме того, по нашему мнению для исследования проблемы апоптоза многоядерных МФ и проведения цитологического анализа этих клеток небезынтересно, что поскольку наблюдаются различия в структуре и функциях многоядерных клеток различных типов [4], то выделение уточняющих признаков, характеризующих клетки, требуется для адекватного проведения цитологического анализа.

В частности, распределение белков Bad и Bcl-2 в цитоплазме может обладать определенными особенностями. Возможно, существует зависимость локализации этих белков в цитоплазме клеток, которые разнятся по своим структурным и функциональным характеристикам, что может относиться также к МФ нескольких типов, причисляемых также к многоядерным производным этих клеток.

При проведении цитологического анализа культур перитонеальных МФ с применением методов иммуноцитохимического детектирования белков Bad и Bcl-2 в цитоплазме клеток было выделено несколько типов распределения этих белков в эндоплазме МФ, принадлежащих к различным классам ядерности. Регистрировали мононуклеарные и двуядерные МФ с преимущественной локализацией белков Bad и Bcl-2 в нескольких зонах периферической области эндоплазмы.

В клеточных культурах отмечали присутствие двуядерных МФ с локализацией белков Bad и Bcl-2 в одной зоне периферической области эндоплазмы и с локализацией этих белков вокруг ядер. Многоядерные МФ содержали белки Bad и Bcl-2 в межъядерной зоне, как и бинуклеарные МФ. Тогда как у МФ всех учитываемых классов ядерности регистрировали присутствие белков Bad и Bcl-2 также в зоне эндоплазмы, находящейся между центральной и периферической областью таковой.

Возможно, что вышеописанные варианты локализации в цитоплазме МФ белков Bad и Bcl-2 были детерминированы характером реализации внутриклеточных процессов, протекающих в соответствующих зонах эндоплазмы, что необходимо учитывать при проведении иммуноцитохимического анализа клеточных культур, содержащих МФ, разнящиеся по классам ядерности.

Заключение

Таким образом, результаты исследования свидетельствуют о существовании различий в динамике экспрессии проапоптогенных и антиапоптотических белков-регуляторов у МФ, класс ядерности которых обусловливает специфику реализации их апоптоза. При этом характер изменения численного состава субпопуляций многоядерных МФ был детерминирован не только интенсивностью процесса их апоптоза, но и напряженностью реакций мультинуклеации, на что указывала положительная динамика формирования данных макрофагальных производных в условиях БЦЖ-инфицированности. Изучение вышеизложенных аспектов представляется актуальным в плане создания перспективных методов цитологической диагностики и терапевтической коррекции гранулематозных заболеваний.


Библиографическая ссылка

Ильин Д.А. ИССЛЕДОВАНИЕ ЭКСПРЕССИИ БЕЛКОВ-РЕГУЛЯТОРОВ АПОПТОЗА BAD И BCL-2 МНОГОЯДЕРНЫМИ ПЕРИТОНЕАЛЬНЫМИ МАКРОФАГАМИ БЦЖ-ИНФИЦИРОВАННЫХ МЫШЕЙ // Международный журнал прикладных и фундаментальных исследований. – 2018. – № 3. – С. 54-58;
URL: http://applied-research.ru/ru/article/view?id=12148 (дата обращения: 23.05.2019).

Предлагаем вашему вниманию журналы, издающиеся в издательстве «Академия Естествознания»
(Высокий импакт-фактор РИНЦ, тематика журналов охватывает все научные направления)

«Фундаментальные исследования» список ВАК ИФ РИНЦ = 1.252