Научный журнал
Международный журнал прикладных и фундаментальных исследований

ISSN 1996-3955
ИФ РИНЦ = 0,570

ФАКТОРЫ ВИРУЛЕНТНОСТИ ЭНТЕРОКОККОВ

Миронова А.В. 1
1 Тихоокеанский государственный медицинский университет
В течение многих лет энтерококки не рассматривались как клинически значимые возбудители инфекционной патологии [1,2,3]. Но все чаще их стали выделять из клинического материала при различных патологических состояниях. Просмотр этиологического значения энтерококков способствовал выявлению у них факторов патогенности, а именно: гемолитических, протеолитических, адгезивных свойств. Особое значение имеет способность энтерококков быстро приобретать и распространять устойчивость ко многим антимикробным препаратам [4, 5, 6]. Возникновение и распространение резистентности энтерококков вследствие селективного давления антибиотиков на нормальную микрофлору в процессе интенсивной, часто нерациональной, антибиотикотерапии является серьезной клинической и экологической проблемой [7, 8].
воспалительные заболевания органов малого таза
энтерококковая инфекция
1. Schaberg D.R., Culver D.H., Gaynes R.P. Major trends in microbial aetiology of nosocomial infection. Am J Med 1991;91:72s-5s.
2. Mollering R.C. Jr. Emergence of Enterococcus as significant pathogen. Clin Infect Dis 1992;14:1173-8.
3. Murray B.E. The life and times of Enterococcus. Clin Microbial Rev 1990;3:45-65.
4. Tendulkar P.M., Baghdayan A.S., Shankar N. Pathogenic Enterococci: New developments in the 21 st Century. Cell Mole Life Sci 2003;60:2622-36.
5. Ike Y., Hashimoto H., Clewell D.B. Haemolysin of Streptococcus faecalis subspecies zymogenes contributes to virulence in mice. Infect Immun 1984;45:528-30.
6. Pearson H. ‘Superbug’ hurdles key drug barrier. Nature 2002;418:469.
7. Marion A.K., Rose A.D., Timothy F.J., Bryan P.S., Kelly M., Susan C. et al . Response to emerging infection leading to outbreak of Linezolid-resistant Enterococci. Emerg Infect Dis 2007;13:1024-30.
8. Paulson I.T., Banerjee L., Myers G.S., Nelson K.E., Seshadri R., Read T.D., et al. Role of mobile DNA in the evolution of Vancomycin-resistant Enterococcus faecalis . Science 2003;299:2071-4.
9. Hacker J., Kaper J.B. Pathogenicity islands and the evolution of microbes. Annu Rev Microbial 2000;54:641-79.
10. Huycke M.M., Spiegel C.A., Gilmore M.S. Bacteraemia caused by haemolytic high level gentamycin-resistant Enterococcus faecalis. Antimicrob Agents Chemother 1991;35: 1626-34.
11. Sahm D.F., Kissinger J., Gilmore M.S., Murray P.R., Mulder R., Solliday J., et al. Invitro susceptibility studies of Vancomycin-resistant Enterococcus faecalis.Antimicrob Agents Chemother 1989;33:1588-91.
12. Shankar N., Baghdayan A.S., Gilmore M.S. Modulation of virulence within a pathogenicity island in Vancomycin-resistant Enterococcus faecalis. Nature 2002;417:746-50.
13. Hancock L.E., Gilmore M.S. Pathogenicity of Enterococci: In gram positive pathogens. Am Soc Microbiol 2000;251-8.
14. Garsin A.D., Sifri C.D., Mylonakis E., Qin X., Singh K.V., Murray B.E., et al A simple model host for identifying gram positive virulence factors. Proc Natl Acnd Sci 2001;98:10892-7.
15. Jett B.D., Huycke M.M., Gilmore M.S. Virulence of Enterococci. Clin Microbial Rev 1994;7:462-78.
16. Nallapareddy S.R., Qin X., Weinstock G.M., Hook M., Murray B.E. Enterococcus faecalis adhesion, Ace mediates attachment to extracellular matrix proteins collagen type IV and laminin as well as collagen Type I. Infect Immun 2000;68:5218-24.
17. Sartingen S., Rozdzinski E., Muscholl-Silberhorn A. Aggregation substances increases adherence and internalization but not translocation of Enterococcus faecalis through different intestinal epithelial cells invitro. Infect Immun 2000;68:6044-7.
18. Shankar V., Baghdayan A.S., Huycke M.M., Lendahl G., Gilmore M.S. Infection derived Enterococcus faecalis strains are enriched in esp, a gene encoding a novel surface protein Infect Immun 1999;67:193-200.
19. Hass W., Shepard B.D., Gilmore M.S. Two-component regulator of Enterococcus faecalis cytolysin responds to quorum-sensing autoinduction. Nature 2002;415:84-7.
20. Huycke M.M., Abrams V., Moore D.R. Enterococcus faecalis produces extracellular superoxide and hydrogen peroxide that damages colonic epithelial cell DNA. Carcinogenesis 2002;23:529-6.
21. Chow J.W., Thal L.A., Perri M.B., Vazquez J.A., Donabedian S.M., Clewell D.B., et al. Plasmid-associated hemolysin and aggregation substance production contribute to virulence in experimental Enterococcal endocarditis. Antimicrob Agents Chemother 1993;37:2474-7.
22. Ike Y., Hashimoto H., Clewell D.B. High incidence of hemolysin production by Enterococcus (Streptococcus) faecalis strains associated with human parenteral infections. J Clin Microbiol 1987;25:1524-8.
23. Johnson A.P. The pathogenicity of Enterococci. J Antimicrob Chemother 1994;33:1083-9.
24. Vergis E.N., Nathan S., Joseph W.C., Hayden M.K., Syndman D.R., Zervos, et al. Association between the presence of Enterococcal virulence factors gelatinase, haemolysin and enterococcal surface protein and mortality among patients with bacteremia due to Enterococcus faecalis . Clin Infect Dis 2002;35:570-5.
25. Kreft B., Marre R., Schramm U., Wirth R. Aggregation substance of Enterococcus faecalis mediates adhesion to cultured renal tubular cells. Infect Immun 1992;60:25-30.
26. Gutschik E., Moller S., Christensen N. Experimental endocarditis in rabbits, 3: Significance of the proteolytic capacity of the infecting strains of Streptococcus faecalis . Acta Pathol Microbiol Scand 1979;87:353-62.
27. Peng H.L., Novick R.P., Kreiswirth B., Kornblum J., Schlievert P. Cloning, characterization and sequencing of an accessory gene regulator (agr) inStaphylococcus aureus. J Bacteriol 1988;170:4365-72.
28. Shankar N., Lockatell C.V., Baghdayan A.S., Drachenberg C., Gilmore M.S., Johnson D.E. Role of Enterococcus faecalis surface protein Esp in the pathogenesis of ascending urinary tract infection. Infect Immun 2001;69:4366-72.
29. Clewell D.B. Bacterial sex pheromone-induced plasmid transfer. Cell 1993;73:9-12.
30. Mundy L.M., Sahm D.F., Gilmore M.S. Relationship between enterococcal virulence and antimicrobial resistance. J Clin Microbiol 2000;13:513-22.
31. Sussmuth S.D., Muscholl-Silberhorn A., Wirth R., Susa M., Marre R., Rozdzinski E. Aggregation substance promotes adherence, phagocytosis and intracellular survival of Enterococcus faecalis within human macrophages and suppresses respiratory burst. Infect Immun 2000;68:4900-6.
32. McCormick J.K., Hirt H., Waters C.M., Tripp T.J., Dunny G.M., Schlievert P.M. Antibodies to a surface-exposed, N-terminal domain of aggregation substance are not protective in the rabbit model of Enterococcus faecalis infective endocarditis. Infect Immun 2001;69:3305-14.
33. Vanek N.N., Simon S.I., Jacques-Palaz K., Mariscalco M.M., Dunny G.M., Rakita R.M. Enterococcus faecalis aggregation substance promotes opsonin-independent binding to human neutrophils via a complement receptor type 3-mediated mechanism. FEMS Immunol Med Microbiol 1999;26:49-60.
34. Rich R.L., Kreikemeyer B., Owens R.T., LaBrenz S., Narayana S.V., Weinstock G.M., et al. Ace is a collagen-binding MSCRAMM from Enterococcus faecalis . J Biol Chem 1999;274:26939-45.
35. Duh R.W., Singh K.V., Malathum K., Murray B.E. In vitro activity of 19 antimicrobial agents against Enterococci from healthy subjects and hospitalized patients and use of an ace gene probe from Enterococcus faecalis for species identification. Microb Drug Resist 2001;7:39-46.
36. Nallapareddy S.R., Singh K.V., Duh R.W., Weinstock G.M., Murray B.E. Diversity of ace, a gene encoding a microbial surface component recognizing adhesive matrix molecules, from different strains of Enterococcus faecalis and evidence for production of ace during human infections. Infect Immun 2000;68:5210-7.
37. Nallapareddy S.R., Weinstock G.M., Murray B.E. Clinical isolates of Enterococcus faecium exhibit strain-specific collagen binding mediated by Acm, a new member of the MSCRAMM family. Mol Microbiol 2003;47:1733-47. [PUBMED] [FULLTEXT].
38. Hancock L.E., Gilmore M.S. The capsular polysaccharide of Enterococcus faecalis and its relationship to other polysaccharides in the cell wall. Proc Natl Acad Sci 2002;99:1574-9.
39. Huebner J., Wang Y., Krueger W.A., Madoff L.C., Martirosian G., Boisot S., et al. Isolation and chemical characterization of a capsular polysaccharide antigen shared by clinical isolates of Enterococcus faecalis and vancomycin-resistant Enterococcus faecium . Infect Immun 1999;67:1213-9.
40. Huebner J., Quaas A., Krueger W.A., Goldmann D.A., Pier G.B. Prophylactic and therapeutic efficacy of antibodies to a capsular polysaccharide shared among Vancomycin-sensitive and -resistant enterococci. Infect Immun 2000;68:4631-6.
41. Huycke M.M., Moore D., Joyce W., Wise P., Shepard L., Kotake Y., et al . Extracellular superoxide production by Enterococcus faecalis requires Demethylmenaquinone and is attenuated by functional terminal quinol oxidases. Mol Microbiol 2001;42:729-40.
42. Huycke M.M., Gilmore M.S. In vivo survival of Enterococcus faecalis is enhanced by extracellular superoxide production. Adv Exp Med Bio 1997;418:781-4. [PUBMED] [FULLTEXT].

В настоящее время установлено, что вирулентность микроорганизма регулируется генами, кодирующими вирулентность, находящимися в особых регионах генома, которые именуются островками патогенности (pathogenicity islands, PAI) [9]. PAI энтерококка были впервые идентифицированы в геноме мультирезистентного к антибиотикам штамма E. faecalis [MMH594], который был причиной вспышки внутрибольничной инфекции в 1980-х годах [10]. Размер гена энтерококка составляет около 150 Кб и кодирует до 129 открытых рамок считывания (ORF).

Поразительная особенность была выявлена путем сравнения последовательностей, составляющих PAI в штамме MMH594 между V583 и V586 [11]. Была обнаружена способность модулировать вирулентность организма путем селективного удаление конкретных островков патогенности. Сравнение между подвидами ванкомицин-резистентных энтерококков также выявило высокую степень идентичности последовательностей PAI за исключением присутствия или отсутствия отдельных элементов. Способность к изменениям подобного рода позволяет энтерококку перемещаться в различные биотопы хозяина, вызывая развитие патологического процесса [12]. Однако такие способности – далеко не единственный фактор вирулентности энтерококков. Ряд исследований [13], [14], [15], [16], [17], [18], [19], [20] определили различные факторы вирулентности, наиболее важными из которых являются гемолизин, желатиназа, энтерококковый поверхностный белок (ESP), агрегативная субстанция (AS), Асе MSCRAMM, капсульные полисахариды и углеводы клеточной стенки бактерий, супероксид.

Гемолизин – цитолитический белок, способный лизировать эритроциты человека, лошади и кролика. Гемолизин продуцируют штаммы энтерококка, которые продемонстрировали высокую вирулентность в экспериментальных исследованиях у животных и в клинических условиях у человека [5, 21, 22], продукция гемолизина ассоциируется с повышением тяжести инфекционного процесса [23]. Гемолизин выявляется при посеве энтерококка на питательный агар на основе бульона из говяжьего сердца с добавлением 5 % крови лошади. Чашки Петри инкубируются в СО2 камере при температуре в 37 °С с контролем через 24 и 48 часов. Четкая зона гемолиза вокруг колоний микроорганизмов позволяет говорить о наличии гемолизина [24]. Экспрессия гемолизина или цитолизина определяется двухкомпонентной регулирующей системой через кворум-чувствительный механизм [19].

Желатиназа – протеаза, продуцируемая энтерококками, которая способна гидролизовать желатин, коллаген, казеин, гемоглобин и другие пептиды [25]. Было показано, что желатиназа, продуцируемая штаммами E. faecalis , отвечает за вирулентность микрпоорганизма при экспериментальном эндокардите у животных [26]. Способность продуцировать желатиназу в лабораторных условиях может быть выявлена при посеве энтерококков на среду из свежеприготовленного пептон-дрожжевого экстракт-агара, содержащего желатиновые пластинки. Чашки Петри инкубируют при 37 °С в течение ночи, затем охлаждают до комнатной температуры в течение двух часов. Наличие зон гало вокруг колоний свидетельствует о положительном результате [24, 27].

Энтерококковый поверхностный белок (Enterococcal surface protein [ESP] – это связанный с клеточной стенкой микроорганизма протеин, чаще обнаруживаемый у штаммов, перешедших в патогенную форму, чем у сапрофитных энтерококков (18). ПЦР амплификация гена ESP может быть выполнена при помощи праймеров ESP11 (5’-TTGCTAATGCTAGTCCACGACC-3’) и Esp 12 (5’-GCGTCAACACTTGCATTGCCGAA-3’), которые соответствуют нуклеотидным позициям 1217-1238 и 2149-2171 соответственно, внутри N-терминала Esp (24). Микст для ПЦР реакции состоит из 250 нг DNA; по 0.2 µL dATP [2’-диоксиаденозин 5’-трифосфат], dCTP [2’-диоксицитозин 5’-трифосфат], dGTP [2’-диоксигуанозин 5’-трифосфат], and dTTP [2’-диокситимидин 5’-трифосфат]; 2.5 mM MgCl2; и 2.5 U AmpliTaq DNA полимеразы в 1 x реакционном буфере (24).

Образцы проходят инициальную денатурацию при 95 °С в течение двух минут и подвергаются 30 циклам денатурации [94 °С в течение 45 с], отжига [63 °С в течение 45 секунд] и расширения [72°C в течение одного мин]. Пять микролитров амплификационной смеси должны быть смешаны с загрузочным буфером гель и подвергали электрофорезу в один процент агарозном геле. Продукты реакции могут быть визуализированы с помощью окрашивания бромидом этидия. ДНК из культуры E. faecalis MMH594 и FA2-2 может быть использован в качестве положительного и отрицательного контролей соответственно для гена ESP [24].

Показано, что ESP увеличивает анибиотико-резистентность E. faecalis в мочевом пузыре при экспериментальных инфекциях мочевыводящих путей. Для исследования были взяты ESP положительный штамм E. faecalis и изогенный ESP-дефицитный мутантный штамм. В ходе исследования, группы мышей заражали трансуретрально в дозе 100000 CFU ESP содержащего и контрольного щтамма. Через 5 дней бактерии были подсчитаны в моче, мочевом пузыре и почках. У экспериментальных мышей, зараженных штаммом E. Faecalis, содержащим ESP, обнаружено достоверно большее число бактерий. Сделан вывод о том, что ESP способствует фиксации E. Faecalis к эпителию мочевого пузыря [28].

Агрегативная субстанция (AS) является феромон индуцируемым поверхностным белком E. Faecalis, который способствует образованию агрегатов спаривания во время конъюгации бактерий [29]. AS является медиатором эффективного энтерококкового контакта донор-реципиент для осуществления трансфера плазмиды. В естественных условиях, AS может участвовать в патогенезе энтерококковой инфекции посредством ряда механизмов [30]. К различным функциям, приписываемым AS, в дополнение к продвижению межклеточного контакта, является адгезия к клеткам-хозяевам, включая адгезию к белкам внеклеточного матрикса белков и увеличение гидрофобных свойств поверхности клетки. Было установлено, что энтерококки, обладающие AS, значительно более резистентны к фагоцитозу, чем изогенные AS-отрицательные штаммы, в связи с угнетающим воздействием на дыхательный обмен (производство активных форм кислорода) в макрофагах [31, 33].

«Асе» – это коллаген, связывающий MSCRAMM (Microbial surface component recognizing adhesive matrix molecule) что можно перевести, как микробные поверхностные компоненты, распознающие адгезивные молекулы матрикса. Этот фактор вирулентности присутствует как у сапрофитных, так и патогенных штаммах энтерококков [34, 35]. При энтерококковой инфекции у человека производятся антитела к Асе, которые блокируют адгезию протеинам экстрацеллюлярного матрикса in vitro [16, 36]. Этот компонент вирулентности выделен в 90 % наблюдений при эндокардите энтерококковой этиологии, что подтверждает его экспрессию in vivo. Аналог Асе, обозначенный как Асм, выделен в культуре E. Faecium [37].

Капсульные полисахариды и углеводы клеточной стенки бактерий. Оперон, кодирующий синтез капсулярного полисахарида наиболее часто обнаруживается у патогенных вариантов E. faecalis [38]. Была определена химическая формула второго вида капсулярного полисахарида, находящегося на поверхности как E. Faecalis, так и E. Faecium [39]. В экспериментальном исследовании, проведенном на инфицированных энтерококками мышах, были показаны защитные свойства антител, вырабатываемых против очищенной углеводной фракции клеточной стенки энтерококков. Высказано предположение о возможном использовании данных антител для профилактики энтерококковых инфекций [40]. Очищенная углеводная фраукция клеточной стенки состоит из глицерола фосфата, глюкозы и остатков галактозы [40].

Внеклеточный супероксид. Изолированные от кровотока E. faecalis обладают способностями производить супероксид [41]. Производство супероксида, наблюдаемое при смешанных инфекциях с Bacteroides fragilis подкожной локализации, целесообразно для повышения выживаемости микроорганизма [42].

Заключение

Энтерококки, которые считались безобидными сапрофитными микроорганизмами, проживающими в кишечнике, в последние десятилетия явились причинами тяжелых инфекционных процессов различной локализации, отличаясь широкой антибиотикорезистентностью и выраженной вирулентностью. Проведенные исследования выявили многочисленные островки патогенности (PAI) и генетические различия между сапрофитными и патогенными штаммами энтерококков, обладающих генами, кодирующими продукцию агрессивных протеинов различного вида (1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8).

Необходимо проведение дальнейших исследований для выяснения механизмов целлюлярного и молекулярного взаимодействия энтерококков с клетками хозяина, ведущего к формированию высоко вирулентных форм энтерококков.


Библиографическая ссылка

Миронова А.В. ФАКТОРЫ ВИРУЛЕНТНОСТИ ЭНТЕРОКОККОВ // Международный журнал прикладных и фундаментальных исследований. – 2015. – № 4-1. – С. 67-70;
URL: http://applied-research.ru/ru/article/view?id=6587 (дата обращения: 02.04.2020).

Предлагаем вашему вниманию журналы, издающиеся в издательстве «Академия Естествознания»
(Высокий импакт-фактор РИНЦ, тематика журналов охватывает все научные направления)

«Фундаментальные исследования» список ВАК ИФ РИНЦ = 1.074