Научный журнал
Международный журнал прикладных и фундаментальных исследований

ISSN 1996-3955
ИФ РИНЦ = 0,686

АНАЛИЗ КОМПОНЕНТОВ ПРОТИВООЖОГОВОГО ПОРОШКА НАРУЖНОГО ПРИМЕНЕНИЯ С 5-НИТРОФУРАЛОМ И ЦИТОХРОМОМ С

Коробко В.М. 1 Воробьева О.А. 1 Мельникова Н.Б. 1
1 Нижегородская Медицинская Академия
Разработан методы контроля качества порошка для лечения ожоговых ран, содержащего смесь цитохрома с, нитрофурала, натрия аскорбата и оксида цинка. УФ – и ВЭЖХ – анализы 5-нитрофурала и натрия аскорбата выполняли, растворяя порошок в смеси ацетонитрил:буферный раствор с pH 6 (υ/υ 27:73), и с последующим удалением осадка. Идентификацию 5-нитрофурала проводили методом УФ – спектроскопии по полосе λ = 375 нм, сопоставляя этот спектр со спектром аци-соли (λ = 450 нм). ОФ ВЭЖХ анализ (идентификацию и количественное определение) 5-нитрофурала и натрия аскорбата выполняли при λ = 310 и 254 нм на колонке Discovery C18 (250×4,6 mm, 5 μm) в изократическом режиме при t = 35 °C. Идентификацию цитохрома с проводили после его растворения порошка в воде, анализируя видимую область спектра (λ = 410–415, 520, 550 нм). Количественное определение железа в цитохроме с выполняли методом ААС после растворения порошка в азотной кислоте, используя лампу полого катода с λ = 248,33 нм, в газовой среде – аргон. Качественный и количественный анализ цинка оксида проводили методом ААС после растворения порошка в азотной кислоте (лампа полого катода λ = 213,9 нм в газовой среде воздух – ацетилен, 2,2 л мин– 1). Проведена валидационная оценка методов количественного определения по показателям правильность, воспроизводимость, линейность и сходимость всех действующих веществ.
контроль качества порошка
цитохром С
нитрофурал
1. Осипов А.Н., Борисенко Г.Г., Владимиров Ю.А. Биологическая роль нитрозильных комплексов гемопротеинов // Успехи биологической химии. – 2007. – № 47. – С. 259–292.
2. Берченко Г.Н. Экспериментально-морфологическое обоснование использования экзогенного монооксида азота при лечении огнестрельных ран // Вестник травматологии и ортопедии им. Н.Н. Приорова. – 2009. – № 4. – C. 49–55.
3. Vanin A.F. Dinitrosyl iron complexes with thiolate ligands: psysico-chemistry, biochemistry and physiology // Nitric Oxide Biol. Chem. – 2009. – № 21. – Р. 1–13.
4. Rakova O.A. Novel «Roussin esters» [Fe2(m2-SR)2(NO)4] as NO donors: synthesis, structural and spectroscopic characterization // J. Inorg. Biochem. – 2001. – Vol. 85. – P. 390.
5. Aldoshin S.M. New class of neutral paramagnetic binuclear sulfur-containing iron nitrosyl complexes // Russ. Chem. Bull., Int. Ed. – 2003. Vol. 52, №8. – P. 1702–1708.
6. Osipov A.N. Regulation of cytochrome c peroxidase activity by nitric oxide and laser irradiation // Biochemistry. – 2006. Vol. 71, № 10. – P. 222.
7. Korobko V.M. The Study of the Complexes of Nitromedicine with Cytochrome c and NO-containing Aqueous Dosage Form in the Wound Treatment of Rats // Nitric Oxide. – 2014. – № 42. – P. 62–69.
8. Фармацевтическая разработка: концепция и практические рекомендации: научно-практическое руководство для фармацевтической отрасли; [под ред. С.Н. Быковского]. – М. Изд-во Перо, 2015. – 79 с.

Новым направлением в хирургии и ожоговой практике является вульнеросорбция, позволяющая удалять экссудат, микроорганизмы и их токсины из раны при помощи сорбционных материалов. Для заживления ожоговых и гнойных ран перспективна разработка адсорбентов, способных не только удалять экссудат и жидкость, но и дополнительно воздействовать на процессы воспаления и регенерации в ране. В этом плане большой интерес представляют собой наружные лекарственные средства (ЛС) в виде порошков, способные воздействовать на рану за счет улучшения микроциркуляции крови в зоне поражения.

Одним из перспективных вазодилатирующих ЛС является монооксид азота (в виде газа) или ЛС, способные образовывать нитрозильные комплексы, генерирующих монооксид азота. В настоящее время доказано, что монооксид азота не только улучшает микроциркуляцию крови, влияет на агрегацию тромбоцитов, но и играет важную роль в течение раневого процесса [1, 2].

Известно, что нитрозильные комплексы железа с серосодержащими лигандами являются депо монооксида азота [3–5]. Наиболее изучены в этом плане нитрозильные комплексы цитохрома с, имеющего железосодержащий порфириновый гем. Дизайн новых нитрозильных комплексов цитохрома с открывает возможности в создании ЛС с заданными биологическими свойствами для разработки современных стратегий в лечении раневых процессов.

Ранее нами было показано, что взаимодействие цитохрома с и нитросодержащих препаратов, таких как нитрит натрия, метронидазол, 5-нитрофурал, 5-нитроксолин, приводит к образованию нитрозильных комплексов цитохрома с, аналогичных нитрозильным комплексам, образованным цитохромом с и газообразным монооксидом азота [6]. На основании этих исследований была предложена комбинированная лекарственная форма «водный гель полисахарида + порошок (нитропрепарат, цитохром с», демонстрирующая в эксперименте на крысах высокие регенеративные и репаративные свойства и вазодилатирующий эффект [7].

В настоящей работе нами исследовано новое ЛС в виде порошка с цитохромом с, в котором в качестве донатора нитроксидной группы был выбран 5-нитрофурал из группы нитрофуранов, эффективных в отношении грамположительных и грамотрицательных бактерий. Роль стабилизатора и активатора восстановленной формы цитохрома с выполнял натрия аскорбат, дополнительным кератолитиком и антисептиком выступал цинк оксид, а в качестве основного сорбента был использован крахмал картофельный.

Целью работы является разработка методов качественного и количественного определения действующих веществ противоожогового порошка, содержащего цитохром с и 5-нитрофурал, как депо монооксида азота на ране, и валидационная оценка методов количественного определения по показателям правильность, воспроизводимость, линейность и сходимость действующих веществ.

Материалы и методы исследования

Реактивы: цитохром с (из сердца лошади) (≥ 95 %, lot STBB7839V, «Fluka» (USA) «Sigma-Aldrich»), нитрофурал (≥ 97 %, Product Number: 59870, «Aldrich» (USA) «Sigma-Aldrich»), натрия аскорбат (≥ 99 %, lot BCBJ1585V, «Fluka» (USA) «Sigma-Aldrich»), оксид цинка (ГОСТ 10262-73), крахмал (≥ 95 %, Product Number: 9005-25-8, «Fluka» (USA) «Sigma-Aldrich»), гидроксид натрия (ГОСТ 4328-77), кислота азотная («ХЧ», ГОСТ 4461-77), ацетонитрил для хроматографии сорт 0 (ТУ 2636-040-44493179-00), вода очищенная, полученная на установке «Elix-3» фирмы «MILLIPORE», удельное сопротивление менее 0,2 µСм.

Анализ электронных спектров был выполнен на UV-vis спектрофотометре Specord S100 Bioline (Analytic Jena, Германия), толщина кварцевой кюветы 10 мм.

ВЭЖХ-анализ 5-нитрофурала и натрия аскорбата проводили на высокоэффективном жидкостном хроматографе марки Shimadzu LC-10 Avp в обращенно-фазовом режиме, колонка Discovery C18 (250×4,6 mm, 5 μm) с диодно-матричным УФ-детектором. Условия хроматографирования: подвижная фаза ацетонитрил—фосфатный буфер 27:73 (ν/ν) в изократическом режиме при скорости потока 1 мл/мин при температуре 35 °C, объем инжекции 20 μL, детектирование при длинах волн 310 и 254 нм, время анализа 10 мин.

Элементный анализ выполняли на атомно-абсорбционном спектрофотометре (ААС) Shimadzu AA 7000. А). Количественное определение железа в цитохроме с проводили с использованием стандартных растворов Fe(NO3)3, лампы полого катода с λ = 248,33 нм, в газовой среде – аргон. Объем пробы – 20 μL. Б). Количественное определение цинка в оксиде цинка проводили непрерывно-пламенным методом, используя стандартные растворы Zn, лампу с полым катодом при λ = 213,9 нм в газовой среде воздух – ацетилен, 2,2 л∙мин-1. Объем пробы – 20 μL.

Стандартные растворы железа с концентрацией 2; 6; 10 мкг/л готовили из ГСО 7872-2000 Fe (10 мг/см3,фон – 1 М HNO3).

Стандартные растворы цинка с концентрацией 0,1; 0,2; 0,4 мг/л готовили из ГСО 7837-2000 Zn (10 мг/см3,фон – 1 М HNO3).

Приготовление модельных смесей 1,2,3: 0,25 г; 0,5 г; 0,75 г (точная навеска) 5-нитрофурала помещают в ступку, перетирают, добавляют 0,05 г цитохрома с, 0,1 г натрия аскорбата, 0,1 г цинка оксида до 100 г крахмала. Смесь перетирают пестиком до однородной желтоватой массы. 0,5 г (точная навеска) полученного порошка переносят в стакан на 50 мл, добавляют 15 мл подвижной фазы ацетонитрил-фосфатный буфер pH 6 в соотношении 27:73 (ν/ν), растворяют, фильтруют через фильтр «синяя лента» в мерную колбу вместимостью 25 мл. Раствор в мерной колбе доводят до метки раствором подвижной фазы (соответствует 50 %, 100 %, 150 % ожидаемой концентрации испытуемого раствора).

Приготовление модельных смесей 4,5,6 выполняют аналогично процедуре приготовления модельных смесей 1,2,3, используя 0,05 г; 0,1 г; 0,15 г (точной навески) натрия аскорбата. Состав смеси: 0,05 г цитохрома с, 0,5 г нитрофурала, 0,1 г цинка оксида и натрия аскорбата, крахмала до 100 г. После растворения порошка в 25 мл раствора подвижной фазы, концентрация натрия аскорбата в испытуемом растворе соответствовала 50 %, 100 %, 150 % от ожидаемой.

Стандартные растворы натрия аскорбата (0,02 мг/мл), 5-нитрофурала (0,1 мг/мл) готовили из стандартных образцов субстанций.

Статистическую обработку проводили по программе Statistica 7.0 (р < 0,05).

Результаты исследования и их обсуждение

Общая схема пробоподготовки для анализа всех действующих веществ представлена ниже:

Методика качественного и количественного определения 5-нитрофурала и натрия аскорбата в порошке.

Идентификацию 5-нитрофурала проводили, используя визуальный тест (переход из желтой в оранжевый цвет аци-соли после добавления 30 % гидроксида натрия) и УФ – спектроскопически, анализируя полученный водно-ацетонитрильный раствор (λ = 375 нм) и, сопоставляя этот спектр со спектром аци-соли (появление плеча λ = 450 нм) (рис. 2).

kor1.wmf

Рис. 1. Общая схема пробоподготовки для анализа действующих веществ порошка

kor2a.wmf kor2b.wmf

а) б)

Рис. 2. УФ-спектры ацетонитрильно-буферного раствора смеси 5-нитрофурала и натрия аскорбата после растворения порошка и удаления осадка: 2 а) исходный раствор; 2 б) после добавления 30 % гидроксида натрия

Натрия аскорбат доказывали тестом с аммиачным раствором серебра по образованию черного осадка серебра.

Два компонента 5-нирофурал и натрия аскорбат анализировали ОФ ВЭЖХ методом после растворения порошка в смеси ацетонитрил:фосфатный буферный раствор pH 6 при объемном соотношении 27:73 и удаления нерастворимого осадка, содержащего цитохром с, оксид цинка и крахмал (рис. 1).

Время выхода пика 5-нитрофурала – 4,8 мин, натрия аскорбата – 2,9 мин на хроматограммах растворов модельных смесей совпадало со временем выхода этих соединений в стандартных растворов в изократическом режиме при t = 35 °C (рис. 3).

Определение линейности проводили на 3 уровнях концентраций для 5-NO2 F и для NaAsc от ожидаемых содержаний в порошке. Уравнения линейной регрессии имеют вид: у = 1.980504e + 007 (5-NO2 F) и у = 4.720793e + 007 (NaAsc). Значения коэффициента корреляции для обоих веществ было равным 0,99, что соответствует критерию приемлемости по показателю линейности [8].

kor3a.wmf

а)

kor3b.wmf

б)

Y = aX + b

a = 1.980504e+007

b = 0.0

R2 = 0.9993153

r = 0.9996576

Внешний стандарт

Средний RF: 2.001672e+007

RF СО: 331384.0

RF %СКО: 1.655536

Уровень

Концентрация, мг/мл

Средняя площадь

Площадь 1

Площадь 2

Площадь 3

1

0,05

1013907

1013676

1011798

1016247

2

0,1

2019115

2014528

2020407

2022411

3

0,15

2937130

2945730

2933428

2932232

kor3c.wmf

в)

kor3d.wmf

д)

Y = aX + b

a = 4.720793e+007

b = 0.0

R2 = 0.9999995

r = 0.9999998

Внешний стандарт

Средний RF: 4.744187e + 007

RF СО: 1613611

RF %СКО: 3.401240

Уровень

Концентрация, мг/мл

Средняя площадь

Площадь 1

Площадь 2

Площадь 3

1

0,01

483528

335186

510289

456766

2

0,022

1038955

1049700

1043742

1023422

3

0,028

1317435

1304687

1338484

1309134

Рис. 3 а, б, в, д. Хроматограммы модельных смесей, содержащих 5-NO2F и NaAsc, и калибровочные графики действующих веществ: 3 а) – модельной смеси 2, содержащей 0,1 мг/мл 5-NO2F при постоянстве концентраций остальных действующих веществ; 3 б) – калибровочный график по 5-NO2F; 3 в) – модельной смеси 5, содержащей 0,02 мг/мл NaAsc при постоянстве концентраций остальных действующих веществ; 3 д) – калибровочный график по NaAsc. Условия: λ = 310 и 254 нм, объем пробы 20 μL, ν потока 1мл/мин, t = 35 °C

Таблица 1

Результаты количественного определения 5-нитрофурала по методу «введено-найдено»

Введено, г

Найдено, г

Выход, %

Метрологические характеристики

0,25

0,24

96

Хср = 100,7

SD = 5,15

RSD = 0,51 %

Е = 4,21 %

0,25

0,27

108

0,25

0,26

106

0,5

0,49

98

0,5

0,48

96

0,5

0,52

104

0,75

0,77

102

0,75

0,72

96

0,75

0,76

101

Таблица 2

Результаты количественного определения натрия аскорбата по методу «введено-найдено»

Введено, г

Найдено, г

Выход, %

Метрологические характеристики

0,05

0,049

98

Хср = 100,1

SD = 9,48

RSD = 0,94 %

Е = 7,44 %

0,05

0,051

102

0,05

0,048

96

0,1

0,09

90

0,1

0,11

110

0,1

0,12

120

0,15

0,14

93

0,15

0,16

106

0,15

0,13

86

kor4.wmf

Рис. 4. Электронный спектр cyt c раствора в присутствии натрия аскорбата

kor5.tif

Рис. 5. Зависимость поглощения от концентрации железа

Правильность методики определяли методом «введено-найдено». Отношение количества введенного 5-нитрофурала к найденному (Хср) в % соответствовало 100,7 %, что характеризует разработанную методику как правильную (табл. 1). Величина Хср для NaAsc, рассчитанная по этому методу соответствовала 100,1 %, что определяет правильность методики определения двух компонентов в одной пробе (табл. 2).

Методика удовлетворяет требования по сходимости для обоих анализируемых компонентов – 5-NO2F и NaAsc, о чем свидетельствуют критерии приемлемости RSD % = 0,51 % и RSD % = 0,94 %, соответственно.

Анализ цитохрома с. Идентификацию сyt c в порошке проводили после его растворения в воде и удаления нерастворимого осадка, анализируя видимую область спектра (λ = 410–415, 520, 550 нм).

Количественное определение проводили методом ААС после растворения его в концентрированной азотной кислоте, используя лампу полого катода с λ = 248,33 нм, в газовой среде – аргон. Результаты с использованием калибровочного графика (уравнение Abs = y = 0.0284 CFe-0.0507, где [СFe] = мкг/л) представлены на рис. 5 и в табл. 3.

Как следует из данных табл. 3, значения относительного стандартного отклонения RSD и стандартного отклонения SD малы и составляют 5,5 % и 0,025 %. В соответствии с требованиями руководства [8] эту методику можно считать правильной и воспроизводимой.

Анализ оксида цинка в порошке. Качественный и количественный анализ цинка оксида в порошке проводили методом ААС после растворения его в азотной кислоте, используя лампу полого катода λ = 213,9 нм в газовой среде воздух – ацетилен, 2,2 л∙мин-1. Процедура выполнения пробоподготовки и анализа в целом аналогична анализу железа в цитохроме с. Калибровочный график (уравнение Abs = y = 0.4829СZn – 0,0018, где [СZn] = мг/л приведен на рис. 6.

kor6.tif

Рис. 6. Зависимость поглощения от концентрации цинка (ААС)

Таблица 3

Результаты анализа железа методом ААС

Действие

Истинное значение концентрации (мкг/л)

Концентрация (мкг/л)

Абсорбция

RSD, %

SD

STD-1

2,000

1,7401

0,0013

6,12

0,023

STD-2

2,000

2,2892

0,0143

STD-3

2,000

1,8774

0,0026

STD-AV

2,000

1,9689

0,0052

STD-1

6,000

5,4533

0,1042

4,14

0,025

STD-2

6,000

3,6161

0,0520

STD-3

6,000

6,6711

0,1388

STD-AV

6,000

6,0622

0,1215

STD-1

10,000

9,2720

0,2127

5,58

0,027

STD-2

10,000

9,5888

0,2217

STD-3

10,000

11,0494

0,2632

STD-AV

10,000

9,9689

0,2325

Cyt с

4,4803

0,1271

6,06

0,024

Cyt с

4,4921

0,1123

Cyt с

4,4823

0,1040

Примечание. * аббревиатура STD относится к стандартам, прилагаемым к прибору.

Таблица 4

Результаты анализа цинка методом ААС

Действие

Истинное значение концентрации (мг/л)

Концентрация (мг/л)

Абсорбция

RSD, %

SD

1

2

3

4

5

6

STD-1

0,100

0,0886

0,0410

1,20

0,005

STD-2

0,100

0,0901

0,0417

STD-3

0,100

0,0885

0,0409

STD-AV

0,100

0,0895

0,0414

STD-1

0,200

0,2092

0,0992

4,35

0,0045

STD-2

0,200

0,2222

0,1055

STD-3

0,200

0,2221

0,1054

STD-AV

0,200

0,2158

0,1024

STD-1

0,400

0,3829

0,1831

4,23

0,0080

STD-2

0,400

0,4063

0,1944

STD-3

0,400

0,3820

0,1829

STD-AV

0,400

0,3947

0,1888

Zn

0,3875

0,1853

3,17

0,0060

Zn

0,4051

0,1938

Zn

0,3964

0,1896

Примечание. * аббревиатура STD относится к стандартам, прилагаемым к прибору.

Как следует из данных табл. 4 значений относительного стандартного отклонения RSD и стандартного отклонения SD, составляющих 3,2 % и 0,006 %, методику определения цинка в порошке можно считать правильной и воспроизводимой.

Выводы

1. Разработана методика УФ – спектрального и ВЭЖ- хроматографического анализов 5-нитрофурала и натрия аскорбата. Рекомендовано:

1) пробоподготовку для анализа проводить растворением порошка в смеси ацетонитрил:фосфатный буферный раствор pH 6 в объемном соотношении 27:73 и удалением нерастворимого осадка цитохрома с, оксида цинка и крахмала фильтрацией.

2) идентификацию 5-нитрофурала выполнять УФ – спектроскопически, анализируя полученный водно-ацетонитрильный раствор (λ = 310 нм) и, сопоставляя этот спектр со спектром аци-соли, полученной добавлением 30 % гидроксида натрия (λ = 420 нм).

3) ОФ ВЭЖХ анализ (идентификацию и количественное определение) 5-нитрофурала и натрия аскорбата проводить при λ = 310 нм на колонке Discovery C18 (250×4,6 mm, 5 μm) в изократическом режиме при t = 35 °C c использованием стандартных растворов. Время выхода пика 5-нитрофурала – 4,8 мин, натрия аскорбата – 2,9 мин.

2. Разработана методика анализа цитохрома с в порошке. Рекомендовано:

а) идентификацию проводить после его растворения порошка в воде, анализируя видимый область спектра (λ = 410–415, 520, 550 нм);

б) количественное определение выполнять методом ААС после растворения его в концентрированной азотной кислоте, используя лампу полного катода с λ = 248,33 нм, в газовой среде – аргон.

3. Разработана методика качественного и количественного анализа цинка оксида в порошке методом ААС в соответствии с которой после растворения его в азотной кислоте, выполнять анализ используя лампу полного катода λ = 213,9 нм в газовой среде воздух – ацетилен, 2,2 л мин –1.

4. Проведена валидационная оценка методов количественного определения по показателям правильность, воспроизводимость, линейность и сходимость 5-нитрофурала, натрия аскорбата, цитохрома с, цинка оксида в порошке.


Библиографическая ссылка

Коробко В.М., Воробьева О.А., Мельникова Н.Б. АНАЛИЗ КОМПОНЕНТОВ ПРОТИВООЖОГОВОГО ПОРОШКА НАРУЖНОГО ПРИМЕНЕНИЯ С 5-НИТРОФУРАЛОМ И ЦИТОХРОМОМ С // Международный журнал прикладных и фундаментальных исследований. – 2015. – № 9-2. – С. 322-328;
URL: http://applied-research.ru/ru/article/view?id=7319 (дата обращения: 22.05.2019).

Предлагаем вашему вниманию журналы, издающиеся в издательстве «Академия Естествознания»
(Высокий импакт-фактор РИНЦ, тематика журналов охватывает все научные направления)

«Фундаментальные исследования» список ВАК ИФ РИНЦ = 1.252