Научный журнал
Международный журнал прикладных и фундаментальных исследований
ISSN 1996-3955
ИФ РИНЦ = 0,564

ОЦЕНКА ВЛИЯНИЯ АРГИНИНСОДЕРЖАЩИХ ПЕПТИДОВ PRO-ARG-GLY И GLY-ARG-PRO НА СОСТОЯНИЕ СИСТЕМЫ ГЕМОСТАЗА В ЭКСПЕРИМЕНТАХ IN VITRO И IN VIVO

Оберган Т.Ю. 1 Григорьева М.Е. 1 Сун Ю. 1
1 ФГБОУ ВО «Московский государственный университет им. М.В. Ломоносова»
Впервые исследовано влияние регуляторных пептидов Pro-Arg-Gly и Gly-Arg-Pro на параметры гемостаза в условиях in vitro и при введении здоровым животным. В экспериментах in vitro во всем диапазоне исследуемых концентраций (от 10-5 до 1 мг/мл) у данных трипептидов выявлено наличие собственной антикоагулянтной активности. При этом они проявляли фибринолитическую активность неферментативного характера и снижали агрегацию тромбоцитов. В условиях in vivo ежедневное (1 раз в сутки) 5-кратное интраназальное введение Pro-Arg-Gly или Gly-Arg-Pro здоровым крысам в дозах 1 мг/кг массы тела приводило к достоверному снижению агрегации тромбоцитов. Также оба пептида вызывали повышение фибринолитической активности плазмы крови, усиливая активность тканевого активатора плазминогена. Увеличение антикоагулянтной активности крови животных установлено только после введения Pro-Arg-Gly. Сравнительный анализ противосвертывающих эффектов исследованных пептидов показал, что Pro-Arg-Gly обладает более выраженным антикоагулянтным, фибринолитическим и антитромбоцитарным действием.
пептиды
гемостаз
антикоагулянтная активность
фибринолиз
агрегация тромбоцитов
1. Ашмарин И.П., Каменский А.А., Ляпина Л.А., Мясоедов Н.Ф., Самонина Г.Е. Глипролины как самостоятельные регуляторы и стабилизаторы других пептидов / // Вопросы биол., мед. и фармацевт. химии. – 2002. – № 1. – С. 24-27.
2. Ашмарин И.П., Каразеева Е.П., Ляпина Л.А., Самонина Г.Е. Простейшие пролинсодержащие пептиды PG, GP, PGP и GPGG: регуляторная активность и возможные источники биосинтеза / // Биохимия. – 1998. – Т.63. – № 2. – С. 134-141.
3. Кузник Б.И. Клеточные и молекулярные механизмы регуляции системы гемостаза в норме и патологии / Б.И.Кузник. Чита: Экспресс-издательство, 2010. – 832 с.
4. Ляпина Л.А., Григорьева М.Е., Оберган Т.Ю., Шубина Т.А. Теоретические и практические вопросы изучения функционального состояния противосвертывающей системы крови – М.: Адвансед Солюшнз, 2012. – 160 с.
5. Ляпина Л.А., Мясоедов Н.Ф., Григорьева М.Е., Шубина Т.А., Андреева Л.А. Современная концепция регуляторной роли пептидов глипролинового ряда в коррекции функции системы гемостаза при развитии сахарного диабета // Известия РАН. Сер. биол. – 2013. – № 4. – С. 453-462.
6. Ляпина Л.А., Пасторова В.Е., Оберган Т.Ю., Самонина Г.Е., Ашмарин И.П., Мясоедов Н.Ф. Сравнение противосвертывающих эффектов регуляторных пролинсодержащих пептидов. Специфичность действия глипролинов, Семакса и Селанка, возможности их практического применения // Известия РАН. Сер.биол. – 2006. – № 2. – С. 193-203.
7. Freedman J.E., Loscalzo J. Nitric oxide and its relationship to thrombotic disorders // J.Thromb. Haemost. – 2003. – V. 1. – P. 1183-1188.
8. Golubeva M., Grigorjeva M. Influence of arginine-containing peptides on the haemostasis system // Arginine amino acid / Ed.: N.L.Jacobs. – New York: Nova Science Publishers, Inc., 2011. – Р.229-235.
9. Hasan A.A., Warnock M., Nieman M., Srikanth S., Mahdi F., Krishnan R., Tulinsky A., Schmaier A.H. Mechanisms of Arg-Pro-Gly-Phe inhibition of thrombin // Am. J. Physiol. Heart Circ. Physiol. – 2003. – V. 285 (1). – P. 183-193.
10. McConell G.K. Effects of L-arginine supplementation on exercise metabolism // Curr. Opin. Clin. Nutr. Metab. Care. – 2007. – V. 10, № 1. – Р. 46-51.

Из многочисленных исследований известно, что многие регуляторные пептиды (РП) способны влиять на процессы гомеостаза, в том числе и свертывания крови [1, 6]. Среди РП известен ряд коротких глицин- и пролинсодержащих пептидов (глипролинов), являющихся фрагментами коллагена и эластина [2]. Было показано, что глипролины в условиях как in vitro, так и in vivo обладают антикоагулянтными свойствами, ускоряют фибринолиз, а также снижают адгезию и агрегацию тромбоцитов [6]. В настоящее время особое внимание уделяется изучению механизмов действия на гемостаз пептидов, имеющих в своем составе аминокислоту аргинин. По данным литературы известно, что аргинин усиливает антикоагулянтные свойства плазмы крови и препятствует процессам образования тромбов [10]. L-аргинин вырабатывает в организме оксид азота NO, который принимает участие в осуществлении некоторых физиологических функций – снижении агрегации тромбоцитов, вазодилатации, регуляции тонуса гладких мышц [7]. Ранее было показано антитромбоцитарное и антикоагулянтно-фибринолитическое действие пептидов Pro-Gly-Arg, Pro-Gly-Pro-Arg, Arg-Pro-Gly и Gly-Pro-Arg в условиях экспериментального аллоксанового диабета и гипергликемии у животных [5]. Известно, что изменение аминокислотной последовательности в структуре пептидов может приводить к значительным изменениям их свойств [8]. В связи с этим, в настоящее время большой интерес продолжают вызывать исследования, посвященные проблемам изучения эффектов глипролинов на гемостаз и взаимосвязи механизмов действия РП с их структурными особенностями.

Целью работы являлось изучение влияния на параметры гемостаза аргининсодержащих пептидов Pro-Arg-Gly и Gly-Arg-Pro в условиях in vitro и при их многократном интраназальном введении здоровым животным.

Материалы и методы исследования

В экспериментах использовали трипептиды Pro-Arg-Gly и Gly-Arg-Pro, синтезированные в лаборатории регуляторных пептидов Института молекулярной генетики РАН. Исследуемые пептиды растворяли в 0,85 % физиологическом растворе NaCl.

В условиях in vitro определяли антикоагулянтную активность исследуемых препаратов пептидов по тесту активированного частичного тромбопластинового времени (АЧТВ) общепринятым способом с использованием полуавтоматического анализатора АСКа-02 «Астра»; суммарную (СФА) и неферментативную (НФ) фибринолитическую активность препаратов определяли на пластинах нестабилизированного фибрина по методу Кудряшова и др. [4]. Антитромбоцитарное действие пептидов оценивали по изменению АДФ-индуцированной агрегации тромбоцитов в богатой тромбоцитами плазме крови по методу Борна с использованием в качестве индуктора раствор АДФ в конечной концентрации 2 мкМ [4]. При этом в образцы, содержащие 0,1 мл нормальной плазмы крыс, добавляли по 0,05 мл растворов пептидов в исследуемых концентрациях (от 10-5 до 1 мг/мл). Контролем служили образцы нормальной плазмы, к которой вместо исследуемых препаратов добавляли 0,89 % физиологический раствор NaCl.

Эксперименты in vivo были проведены на 30 белых крысах-самцах Wistar (250 ± 20 г). Животные содержались в стандартных условиях вивария (при искусственном освещении по 12 ч темного и светлого времени, принудительной вентиляции, температуре 20–23 °С и относительной влажности 60-70 %) при свободном доступе к пище и воде. Содержание и использование животных осуществляли с соблюдением принципов биоэтики в соответствии с международными принципами Европейской конвенции по защите позвоночных животных, используемых для экспериментальных и иных научных целей.

Производили интраназальное ежедневное (1 раз в сутки) в течение 5 дней введение препаратов пептидов Pro-Arg-Gly (1 группа) и Gly-Arg-Pro (2 группа) в дозах 1 мг/кг массы тела животного в объеме 0,02 мл. Контрольным животным (3 группа) интраназально вводили по 0,02 мл 0,85 % физиологического раствора NaCl. Кровь на исследование биохимических параметров гемостаза брали через 1 ч после последнего введения пептидов из вены jugularis в количестве 1,5 мл с использованием в качестве консерванта 3,8 % лимоннокислый натрий (9:1). Образцы крови центрифугировали при 1000g в течение 5 мин для получения богатой тромбоцитами плазмы, в которой измеряли агрегацию тромбоцитов (АТ) по Борну. Повторное центрифугирование образцов осуществляли при 3000g в течение 15 мин для получения плазмы, бедной тромбоцитами, в которой определяли антикоагулянтную активность по тесту АЧТВ, СФА и НФ на пластинах нестабилизированного фибрина, ферментативную фибринолитическую активность (ФФ) и активность тканевого активатора плазминогена (ААП) на пластинах стабилизированного фибрина [4].

Статистическую обработку результатов проводили с использованием t-критерия Стьюдента.

Результаты исследования и их обсуждение

В первой серии экспериментов пептиды Pro-Arg-Gly и Gly-Arg-Pro были исследованы на наличие антикоагулянтных, фибринолитических и антиагрегационных свойств в условиях in vitro.

Как видно из табл. 1, оба пептида при добавлении к плазме крови при всех исследуемых концентрациях обладали заметной антикоагулянтной активностью, т.е. замедляли время образования фибринового сгустка. По тесту АЧТВ отмечено достоверное удлинение времени свертывания плазмы при добавлении к пробам и Gly-Arg-Pro (на 37 – 89 % по сравнению с контролем), и пептида Pro-Arg-Gly (на 44 – 98 % по сравнению с контролем).

Таблица 1

Показатели гемостаза при действии пептидов Pro-Arg-Gly и Gly-Arg-Pro в условиях in vitro

Показатели гемостаза

Препараты

Концентрации пептидов, мг/мл

10-5

10-3

10-1

1

АЧТВ, с

1. Pro-Arg-Gly

39.3 ± 0.446 **

37.0 ± 2.07**

32.3 ± 0.74*

31.7 ± 1.6

2. Gly-Arg-Pro

39.3 ± 0.4 **

31.7 ± 3.69*

31.9 ± 1.02**

29.4 ± 2.66*

3. Контроль

20.8 ± 0.92

18.6 ± 0.9

22.4 ± 1.01

21.5 ± 1.05

СФА, мм2

1. Pro-Arg-Gly

50 ± 4.5*

26.25 ± 4.32

30.5 ± 3.05*

39.5 ± 3.9*

2. Gly-Arg-Pro

36 ± 1.0**

31.75 ± 4.9

30 ± 1.2**

27.75 ± 3.1

3. Контроль

22.5 ± 1,21

25 ± 1.12

20 ± 0.9

22.5 ± 0.95

НФ, мм2

1. Pro-Arg-Gly

28,5 ± 1.72**

12 ± 1.2*

27 ± 1.14**

30 ± 1.4**

2. Gly-Arg-Pro

23.75 ± 4.0*

23.75 ± 1.44

30.12 ± 0.14**

25 ± 1.1**

3. Контроль

14 ± 1.1

20.5 ± 2.06

16 ± 0.8

17.5 ± 0.9

Агрегация тромбоцитов, %

1. Pro-Arg-Gly

18.3 ± 0.34

17.5 ± 0.35*

18.4 ± 0.42

18.6 ± 0.46*

2. Gly-Arg-Pro

20.3 ± 0.34

19.6 ± 0.46

20.0 ± 0.46

18.2 ± 0.40*

3. Контроль

19.0 ± 0.4

20.4 ± 0.5

19.8 ± 0.9

20.6 ± 0.38

Примечание: *p < 0,05; **p < 0,01 – различия достоверны по сравнению с контролем (группа 3).

Изучение влияния пептидов на фибринолитическую активность плазмы крови показало, что добавление пептида Pro-Arg-Gly приводило к достоверному повышению СФА на 53 – 122 % по сравнению с контролем во всем исследуемом диапазоне концентраций (табл. 1). Наряду с этим, при всех концентрациях от 10-5 до 1 мг/мл данный пептид обладал неферментативной фибринолитической активностью, которая возрастала на 69 – 103 % по сравнению с контролем.

При этих условиях добавление пептида Gly-Arg-Pro в концентрациях 1 мг/мл и 10-3 мг/мл к плазме крови приводило к достоверному повышению СФА на 60 и 50 % соответственно по сравнению с контролем за счет увеличения НФ на 43 – 70 %.

Исследование влияния Pro-Arg-Gly и Gly-Arg-Pro на агрегацию тромбоцитов показало уменьшение этого показателя на 10 и 14 % при концентрациях Pro-Arg-Gly 10-3 и 1 мг/мл соответственно, а для Gly-Arg-Pro – на 12 % по сравнению с контрольными образцами только при концентрации 1 мг/мл (табл. 1).

Во второй серии экспериментов исследовали действие Pro-Arg-Gly и Gly-Arg-Pro при их многократном интраназальном введении здоровым животным.

Как видно из табл. 2, введение Pro-Arg-Gly вызывало повышение антикоагулянтного фона плазмы крови животных группы 1, поскольку время образования сгустка по тесту АЧТВ достоверно удлинялось на 22 % относительно контрольных значений. При введении Gly-Arg-Pro достоверных отличий изменения времени свертывания по сравнению с контрольными значениями не выявлено.

Таблица 2

Показатели гемостаза через 1 ч после 5-кратного интраназального введения пептидов Pro-Arg-Gly и Gly-Arg-Pro в дозах 1 мг/кг здоровым животным

Группы животных

АЧТВ, с

СФА, мм2

НФ, мм2

ФФ, мм2

ААП, мм2

АТ, %

Группа 1 Pro-Arg-Gly

(n = 10)

32.3 ± 1.24**

122.4 ± 6.15**

87.5 ± 2.02

31.8 ± 6.19*

34.25 ± 6.01**

11.8 ± 0.78**

Группа 2

Gly-Arg-Pro

(n = 10)

27.8 ± 1.02

100.4 ± 2.23

88.9 ± 2.75

11.7 ± 3.59

16.8 ± 2.79*

18.9 ± 0.92**

Группа 3

NaCl (контроль)

(n = 10)

26.5 ± 0.43

97 ± 3.17

78.1 ± 4.83

17.2 ± 2.37

9.15 ± 1.11

24.4 ± 0.90

Примечание: *p < 0,05; **p < 0,01 – различия достоверны по сравнению с контролем (группа 3), n – количество животных в каждой группе.

Наряду с этим, Pro-Arg-Gly вызывал изменение показателей фибринолитической системы плазмы крови экспериментальных животных: увеличение СФА на 26 % по сравнению с контролем происходило главным образом за счет возрастания ферментативной фибринолитической активности плазмы (на 85 % по сравнению с контролем), обусловленного значительным (в 3,74 раза относительно контрольных значений) усилением активности тканевого активатора плазминогена (табл. 2).

Введение пептида Gly-Arg-Pro приводило к достоверному повышению только ААП в 1,84 раза по сравнению с контролем. При этом достоверного изменения показателей СФА и ФФ не было выявлено.

Следует отметить, что введение и Pro-Arg-Gly, и Gly-Arg-Pro вызывало повышение неферментативной фибринолитической активности плазмы крови животных, но эти отличия от контрольных значений носили недостоверный характер.

В то же самое время введение и Pro-Arg-Gly, и Gly-Arg-Pro приводило к усилению антитромбоцитарных свойств плазмы крови животных. Так, после многократного применения пептида Gly-Arg-Pro в крови животных группы 2 наблюдали достоверное снижение агрегации тромбоцитов на 27 % по сравнению с контрольными значениями. Введение пептида Pro-Arg-Gly приводило к более выраженному снижению агрегации тромбоцитов (на 52 % по сравнению с контролем).

Заключение

Делая сравнительной анализ влияния исследованных пептидов на показатели гемостаза, можно отметить, что пептиды Pro-Arg-Gly и Gly-Arg-Pro при их многократном интраназальном введении здоровым животным влияли на состояние свертывающей и противосвертывающей систем крови в разной степени: Pro-Arg-Gly вызывал умеренное увеличение антикоагулянтной активности, повышал фибринолитический потенциал плазмы крови за счет усиления ФФ, которое было обусловлено эндотелий-зависимой реакцией выброса в кровоток тканевого активатора плазминогена и возрастанием ААП; пептид Gly-Arg-Pro усиливал только активность ААП. Вероятно, это действие исследуемых пептидов неспецифично, так как и другие глипролины ингибируют свертывание крови при интраназальном применении [6].

Помимо этого, применение обоих пептидов приводило к снижению агрегации тромбоцитов, и более сильный антитромбоцитарный эффект был у Pro-Arg-Gly. Снижение агрегации тромбоцитов под действием исследованных нами пептидов может быть обусловлено их взаимодействием с рецепторами тромбоцитов, в том числе гликопротеином IIb-IIIa, с последующим блокированием этих рецепторов [3]. Также по данным Hasan et al. [9] пептиды, содержащие аминокислоту аргинин, ингибируют активность тромбина, что в итоге приводит к антикоагулянтному действию этих пептидов.

Таким образом, трипептиды Pro-Arg-Gly и Gly-Arg-Pro при исследовании in vitro и при введении в организм здоровых животных проявляли выраженные в разной степени антикоагулянтные, фибринолитические и антитромбоцитарные свойства. При этом пептид Pro-Arg-Gly обладал более сильным противосвертывающим действием. Следовательно, полученные нами результаты позволяют предположить, что применение аргининсодержащих коротких регуляторных пептидов может быть перспективно при гиперкоагуляционных нарушениях в системе гемостаза, сопровождающих многочисленные патологии организма.


Библиографическая ссылка

Оберган Т.Ю., Григорьева М.Е., Сун Ю. ОЦЕНКА ВЛИЯНИЯ АРГИНИНСОДЕРЖАЩИХ ПЕПТИДОВ PRO-ARG-GLY И GLY-ARG-PRO НА СОСТОЯНИЕ СИСТЕМЫ ГЕМОСТАЗА В ЭКСПЕРИМЕНТАХ IN VITRO И IN VIVO // Международный журнал прикладных и фундаментальных исследований. – 2017. – № 4-3. – С. 546-549;
URL: https://applied-research.ru/ru/article/view?id=11512 (дата обращения: 22.09.2021).

Предлагаем вашему вниманию журналы, издающиеся в издательстве «Академия Естествознания»
(Высокий импакт-фактор РИНЦ, тематика журналов охватывает все научные направления)

«Фундаментальные исследования» список ВАК ИФ РИНЦ = 1.074