Матриксные металлопротеазы (ММП) – ферменты, экскретируемые разными типами клеток во внеклеточное пространство и способные расщеплять компоненты межклеточного матрикса, обеспечивающих механические свойства ткани: эластин, фибронектин, протеогликаны, коллагены разных типов и их дериваты. ММП резидентных клеток костной ткани принимают прямое участие во всех фазах ее ремоделирования – процесса, направленного на обеспечение роста и обновления кости. Ранее предполагалось, что функция ММП сводится исключительно к расщеплению коллагена при резорбции, однако данные о роли ММП в этом процессе оказались противоречивыми. У нокаутированных мышей по различным ММП не было обнаружено изменений резорбции кости [22], или найдены лишь незначительные кратковременные изменения в деградации матрикса костной ткани [38]. С другой стороны, на культуре остеокластов кролика, крысы и цыплят было показано, что ММП-9 столь же необходима для резорбции костей черепа, как и катепсин К [14, 21]. Обработка остеокластов человека ингибиторами карбангидаразы, закисляющей прелакунарное пространство, и ингибиторами катепсина К снижала степень деградации матрикса кости только на 40 % [20]. Этими же исследователями установлено, что ингибирование ММП приводило к снижению резорбции на 70 %, что говорит о совместной деятельности катепсина К и ММП. Сравнение способности остеокластов к внедрению в коллагеновый и костный матрикс in vitro после обработки культуры синтетическими – RP59794, BB94 – и тканевым ингибиторами ММП показало, что в результате таких экспериментальных воздействий резко снижается способность остеокластов к внедрению в матрикс, что связано в том числе, со сниженной способностью ММП расщеплять неминерализованный коллаген [35]. Известно, что помимо коллагена в прикреплении, а значит, опосредованно и во внедрении остеокластов в костный матрикс играют роль рецепторы не только коллагена, но фибронектина, остеопонтина, тромбосподина, костного сиалопротеина, витронектина [37]. Вероятно, отсутствие этих компонентов в используемом в эксперименте коллагеновом матриксе ослабляет способность остеокластов к инвазии.
Наибольшую роль из всех ММП остеокластов в расщеплении костного матрикса отводят ММП-9. Добавление специфичных ингибиторов ММП-9 к остеокластам, культивированных на костном матриксе, приводило к снижению высвобождения кальция из фрагментов кости в среду на 25 %. При этом в культурах остеокластов, стимулированных ИЛ-1, высвобождение кальция было снижено еще больше – на 36 %, что, очевидно, объяснялось снижением доли остеокластов, образующих резорбционные лакуны, а также уменьшением размера лакун [21]. Инактивация катепсина К синтетическими ингибиторами или нокаутирование клеток линии MDA-MB-231, полученной из опухоли молочной железы, по катепсину К приводило к снижению активности ММП-9 не менее, чем в 3 раза [32], что также свидетельствует в пользу предположения, о том, что для реализации своей функции ММП-9 нуждается в активации катепсином К. На этом основании предполагается, что ММП осуществляют преимущественное внеклеточное расщепление коллагена до телопептидов, в то время как внутреклеточный протеолиз коллагена осуществляет катепсин К. Тем не менее многие иммуногистохимические исследования установили, что катепсин К секретируется в прелакунарное пространство. По-видимому, при оценке проявления резорбционной активности остеокластов необходимо учитывать источник, из которых они были получены. Так, выявлено, что катепсин К необходим в большей степени для ремоделирования трубчатых костей и позвонков, в то время как для ремоделирования костей черепа в большей степени необходимы ММП [14]. Очевидно, это связано со строением костного матрикса, локальной регуляцией экспрессии рецепторов в остеокластах и, как следствие – с различием в фенотипических чертах остеокластов разных отделов скелета, обусловливающих вариации в их функционировании. Таким образом, данный конкретный фенотип остеокластов и их рецепторный аппарат определен влиянием этих факторов.
Если ранее изучалась в основном резорбционная роль ММП, непосредственно связанная с деградацией белков матрикса кости, то к настоящему времени известно, что они являются еще и регуляторными молекулами. Регуляторная функция ММП опосредуется расщеплением специфических связей, благодаря чему происходит активация и инактивация сигнальных молекул. Большинство ММП в костной ткани могут выполнять обе функции.
Так, ММП-1 является интерстициальной коллагеназой. Она способна расщеплять коллаген, а также различные входящие в состав клеточной мембраны белки [3, 41], поэтому предполагают, что ММП-1 играет важную роль в резорбции матрикса костной ткани. Регуляторная роль ММП-1 опосредуется ее способностью расщеплять фибронектин, что позволяет клеткам костной ткани мигрировать [41]. Также ММП-1 наряду с ММП-3 и ММП-9 участвует в процессинге ИЛ-1 и осуществляет его деградацию параллельно с ММП- 2 и ММП-9 [25]. Также было показано, что ММП-1 вместе с ММП-2, ММП-3 увеличивает биологическую активность IGF-1 [33].
ММП-2 расщепляет коллагены I, II, III и IV типа [30], фибронектин, усиливая, тем самым миграцию клеток [29]. Кроме того, она, расщепляя остеонектин в специфических сайтах, наряду с MMП-3, -7, -9, -13, усиливает способность и скорость коллагена связываться с другими молекулами, в том числе, с его рецепторами, что позволяет коллагену и его дериватам выполнять сигнальную функцию [19]. ММП-2 регулирует миграцию, дифференцировку и пролиферацию клеток, связываясь с витронектиновым рецептором [40]. ММП-2, экспрессирующаяся в остеоцитах [5, 24], принимает участие в созревании костного матрикса [32]. Недостаток ММП-2 у нокаутированных по этому ферменту мышей приводит к деформациям склета, снижению минеральной плотности костной ткани губчатой и компактной кости, увеличению гибели остеоцитов в костях черепа [24]. Этими же исследователями показано, что при полном нарушении сети каналов остеоцитов происходит усиление активности остеобластов, а при частичном – дифференцировка остеобластов в остеоциты, что, вероятно, и приводит к уменьшению количества функционирующих остеобластов. Уменьшение количества остеобластов может служить у мышей этой линии причиной снижения плотности костной ткани. При этом показано, что функция остеобластов и остеокластов у нокаутированных по ММП-2 мышей не изменена. Таким образом, у этих животных происходит снижение минеральной плотности костной ткани как за счет уменьшения количества остеобластов, так и нарушения вторичной минерализации, которую должны обеспечивать остеоциты. Недостаток ММП-2 у человека приводит к развитию синдрома Нао, аутосомно-рецессивного системного заболевания, характеризующегося артропатиями и остеопорозом [6].
Методом иммуногистохимии на остеокластах кролика было показано, что в остеокластах ММП-2 синтезируется конститутивно, а синтез ММП-9 индуцируется ИЛ-1 вместе с ММП-1, ММП-3, ТИМП-1 [30].
Способность расщеплять основной компонент внеклеточного матрикса кости – зрелый коллаген I типа и его дериваты, а также фибронектин, – компонент внеклеточного матрикса, ответственный за прикрепления клеток, потенциально делают ММП-2 и ММП-1 важными факторами канцерогенеза и метастазирования опухолей в костную ткань.
ММП-3 расщепляет остеопонтин, декорин, протеогликаны, фибронектин, ламинин и коллаген IV типа, участвуя в миграции клеток и процессинге ИЛ-1 [31].
ММП-7 наряду с ММП-2 и ММП-3 участвует в усилении биологической активности TGF, расщепляя декорин [19], одновременно с ММП-3 снижает способность клеток к адгезии и увеличивает их способность к внедрению в матрикс, расщепляя Е-кадгерин [34], способствует Fas-рецепторопосредованному апоптозу, расщепляя лиганд Fas [29], также ММП-7 путем ограниченного протеолиза RANKL, благодаря чему последний становится растворимым и способным после связывания с RANK индуцировать остеокластогенез и усиливать активность остеокластов. ММП-7, блокируя специфический рецептор интактного фибронектина его протеолитически расщепленным фрагментом, может ослаблять прикрепление клеток к матриксу соединительной ткани [18]. Показано, что у мышей, нокаутированных по ММП-7 количество случаев остеолиза, индуцируемого метастазами рака простаты значительно снижено [16, 28], что, вероятно, связано с уменьшением количества фибронектина в ткани.
Субстратами ММП-9 являются агрекан и коллагены I, II, III и IV типа [15]. Поскольку ММП-9 является индуцибельным ферментом, по ее экспрессии можно судить об активности остеокластов.
Из всех ММП, экспрессирующихся остеокластами, только ММП-13 способна расщеплять трехспиральный коллаген, и, поскольку ММП-2 и ММП-9 являются желатиназами, предполагают, что они участвуют в дальнейшем протеолизе коллагена после воздействия на него истинных коллагеназ: ММП-1, ММП-13 [26]. Производимые ММП-13 при расщеплении фрагменты коллагена I типа инициируют резорбцию кости активированными остеокластами [41]. Вместе с тем, ММП-9 высвобождает из костного матрикса TGF-β, который обусловливает ретракцию остеокластов, увеличивая тем самым, экспозицию поверхности кости и усиливая аттракцию предшественников остеокластов к ее поверхности [23].
ММП-12 экспрессируется в остеокластах черепа и трубчатых костей, т.е. остеокластах, осуществляющих резорбцию компактной костной ткани. Она расщепляет важнейший функциональный домен остеопонтина и сиалопротеина, – двух белков, значительно влияющих на способность остеокластов к прикреплению и резорбции. Однако на нокаутированных мышах по этой металлопротеазе не выявлено нарушения резорбции костной ткани [22]. Вероятно, ее функции могут быть замещены другими протеазами, или данная ММП не играет большой роли в костной резорбции у мышей.
ММП-13 экспрессируется в остеокластах [38] и остеоцитах [13]. При этом предполагают, что функция ММП-13 состоит в зачистке поверхности резорбционной лакуны после воздействия катепсина К, поэтому она обнаруживается в резорбционной лакуне.
ММП-14 расщепляет коллагены I, II, III типа, фибронектин, ламинин-1 и активирует проММП-2 и проММП-13 [41]. В костной ткани она способствует высвобождению RANKL, что приводит к дифференцировке остеокластов из преостеокластов, а также усилению их активности [29]. ММП-14 экспрессируется во всех клетках костной ткани и является главной коллагеназой среди ММП, участвующих в костном ремоделировании. Совместно с рецептором эндоцитоза uPARAP/Endo180 она ответственна за подготовку продуктов внеклеточного протеолиза коллагена к процессу эндоцитоза и таким образом, опосредованно влияет на деградацию коллагена в лизосомах [11]. Показано, ингибирование ММП-14 и ММП-9, обнаруженных в подосомах – структурах, отвечающих за прикрепление остеокластов к матриксу кости, уменьшало время жизни подосом, а следовательно, и способность остеокластов к миграции [36].
Остеобластами продуцируются ММП-1, -2 [8, 17] -13 [10]. Несмотря на то, что часть металлопротеаз синтезируют остеобласты, латентные протеазы могут подвергнуться активации посредством цистеиновых протеаз остеокластов, и, таким образом, принять участие в деградации костного матрикса [12].
С учетом полученных данных в настоящее время предложен следующий механизм ремоделирования костной ткани. Одним из сигналов для миграции остеокластов к будущему месту резорбции являются микропереломы, в результате которых ММП-2 и ММП-13 из поврежденных остеоцитов попадают во внеклеточный матрикс кости. Под их воздействием из внеклеточного матрикса высвобождаются такие цитокины, как RANKL, OPG, M-CSF и TGFβ [18], а также происходит их процессинг, благодаря которому они превращаются в свои активные формы. TGFβ, OPG, IGF-1, BMP стимулируют дифференцировку мезенхимальных стволовых клеток в остеобласты, а RANKL и M-CSF способствуют дифференцировке клеток макрофагального ряда в остеокласты [39]. ММП-13, экскретируемая остеобластами, остеоцитами и выстилающими клетками или попадающая в матрикс костной ткани в результате их повреждения производит расщепление остеоида, обнажая минерализованные участки костного матрикса с дериватами белковых компонентов внеклеточного матрикса. В дальнейшем, эти участки опознаются рецепторным аппаратом остеокластов как место резорбции костной ткани [31]. Увеличение концентрации ММП-13 в матриксе костной ткани происходит не только в результате микропереломов, но и в результате увеличения ее экспрессии в остеоцитах и экскреции под действием гидродинамического удара, вызываемого механическими нагрузками на кость и передающемуся через сеть каналов остеоцитов [42].
Прибывающие к месту резорбции остеокласты взаимодействуют с коллагеном I типа, остеопонтином, костным сиалопротеином или с продуктами их ограниченного протеолиза. После прикрепления остеокласта к поверхности кости он начинает этап резорбции, также сопровождающейся высвобождением факторов роста из матрикса кости. Основную роль на этом этапе играют катепсин К и ММП-9 [2]. После завершения фазы резорбции и апоптоза остеокластов на поверхности резорбционной лакуны остаются специфические продукты протеолиза, которые являются сигналом для прикрепления преостеобластов. Под действием ММП-2 в месте будущего формирования костной ткани происходит дифференцировка преостеобластов в остеобласты. После завершения формирования матрикса и инициации его минерализации происходит либо апоптоз остеобластов, либо превращение их в выстилающие клетки или остеоциты. Дифференцировка остеобластов в остеоциты управляется механической нагрузкой, которые приводят к изменениям фенотипа клеток [4]. Механизм, по которому происходит дифференцировка остеобластов в остеоциты продемонстрирован в эксперименте на остеобластах человека, которыми были заселены подложки, коллаген которых находился в сжатом или растянутом состоянии. Было показано, что через 1 час после заселения подложки, находившейся в сжатом состоянии, остеобласты, начинали экспрессировать маркеры ранней дифференцировки остеобластов – RUNX2, ALP, OPG, а уже через 4 часа – маркер поздней дифференцировки остеобластов, предваряющий их дифференцировку в остеоциты – сиалопротеин. При этом на экспрессию MMП-1 и MMП-3 вектор сил, приложенных к подложке, не оказывал влияния, в то время как сдавливание приводило к увеличению экспрессии MMП-2, MMП-13, MMП-14 в клетке [7]. Результаты этого эксперимента демонстрируют, что ММП-2, -13, -14 принадлежит центральная роль в дифференцировке остеоцитов из остеобластов под давлением.
Накопленные данные о роли ММП свидетельствуют о том, что они выполняют разнонаправленные функции в процессе ремоделирования костной ткани, как и клетки, их выделяющие. К настоящему времени стало больше известно о механизмах ремоделированиях костной ткани, об экспрессии ММП и ее регуляции не только различными цитокинами и гормонами и тканевыми ингибиторами ММП, но и молекулами костного матрикса и его механическими свойствами. Изменения, происходящие в составе костной ткани с возрастом, а также при патологических состояниях, изменяют концентрацию и доступность естественных субстратов для ММП и среду, в которой протекают каталитические реакции протеолиза компонентов внеклеточного матрикса. В свою очередь это изменяет кинетические параметры катализируемых ММП реакций, что может ухудшать состояние процессов ремоделирования костной ткани и поэтому требует изучения. Ухудшение же механических свойств кости вследствие изменения ее состава и характера нагрузки напрямую влияет на экспрессию ММП, запускающих ее ремоделирование.