Scientific journal
International Journal of Applied and fundamental research
ISSN 1996-3955
ИФ РИНЦ = 0,593

STUDY OF THE EFFECT OF FLAVONOIDS ON THE MEMBRANE OF MICROCALORIMETRIC LIPOSOMES FROM PHOSPHATIDYLETHANOLAMINE

Yagolnik Е.A. 1 Kim Yu.A. 2
1 Tula state University
2 Institute of Cell Biophysics
The paper presents the results of an experimental study of the effect of flavonoids of different classes on the membrane of liposomes from phosphatidylethanolamine. Thermodynamic parameters were determined by differential scanning calorimetry and thermograms of melting of bilayer and non-bilayer lipid structures in the presence of catechin, quercetin, dihydroquercetin, and phloretin were characterized. It has been shown that in the temperature range of 15–30oC, the actions of quercetin and dihydroquercetin cause a decrease in the transition height on the thermograms of liposome scanning and an increase in enthalpy. Phloretin has the most significant effect, causing a decrease in the enthalpy of transition from 4.39 kcal/mol to 3.52 kcal/mol, while the half-width of the transition increases by almost 7 times. The phase transition bilayer – hexagonal HII phase, normally observed in the region of 69 oC, in the presence of catechin occurs at a temperature of 71.7oC. A significant change is caused by dihydroquercetin, in the presence of which the enthalpy of transition decreases from 0.49 kcal/mol to 0.32 kcal/mol. Phloretin has little effect on the non-bilayer structure, in contrast to its effect on the bilayer membrane. The possibility of similar changes in the phase state of lipids in cell membranes under the action of flavonoids is assumed, which can lead to a change in the balance between lipids.
flavonoids
membranes
liposomes
microcalorimetry
phosphatidylethanolamine

Большинство исследований взаимодействия полифенольных соединений растительного происхождения с липидами и липидными мембранами, представленных в литературе [1–3], проводились с использованием фосфолипидов, входящих в состав наружной стороны мембран, обычно фосфатидилхолинов, образующих бислой [2, 3]. Однако биологические мембраны состоят из широкого спектра липидов: липидов, которые образуют бислой, и липидов, которые могут принимать небислойные структуры, такие как инвертированная гексагональная фаза (HII) [4]. Фосфатидилэтаноламин, второй по распространенности фосфолипид, является примером этого небислойного класса фосфолипидов, молекулы которого в изолированном виде образуют бислойные структуры в диапазоне температур вблизи точки плавления липида. При дальнейшем нагревании липид претерпевает фазовый переход из бислоя в гексагональную НII фазу, который зависит от различных внутренних и внешних факторов [5]. Предполагается, что небислойные фосфолипиды в силу своей формы образуют локальные переходные структуры, которые, как считается, играют важную роль в жизненно важных клеточных процессах, таких как слияние мембран, образование везикул и деление клеток [6]. Помимо этих процессов, небислойные фосфолипиды воздействуют на функцию мембран, влияя на объемные свойства мембран, которые, в свою очередь, влияют на вставку, укладку и функцию некоторых интегральных мембранных белков [7]. Модулятором фазовых переходов в мембранах могут служить некоторые растительные полифенолы из большого класса флавоноидов. Например, было обнаружено, что некоторые флавоноиды способны инициировать образование небислойной фазы [8] в липидной мембране, процесс которого зависит от количества ОН-групп в молекуле [9].

Несмотря на большое количество опубликованных работ по взаимодействию флавоноидов с липидами in vitro в модельных бислоях (липосомах), действие липидов, способных формировать и изменять небислойные структуры, остается мало изученным.

Цель исследования – исследование влияния флавоноидов на термически индуцированные фазовые переходы фосфолипидов в мембранах липосом.

Материалы и методы исследования

В работе использовали фосфолипид: 1-пальмитоил-2-олеоилфосфатидилэтано-ламин (ФЭ) (Avanti Polar Lipids, USA), флавоноиды (Sigma-Aldrich, USA), Tris-HCl (Serva, Germany).

Приготовление липосом. В круглодонной колбе растворенный в хлороформе фосфолипид фосфатидилэтаноламин (ФЭ) высушивали в струе аргона до образования тонкой пленки на стенке сосуда. Для полного удаления растворителя препарат вакуумировали в течение 24 часов, затем липид гидратировали в 10 мМ Трис-HCl буфере (рН 7,4) путем механического встряхивания на вортексе или шейкере при температуре выше фазового перехода. Для полной гидратации липосом образцы медленно нагревали до температуры 90oС – выше температуры фазового перехода бислоя мембраны в небислойную структуру, охлаждали до комнатной температуры и использовали в экспериментах.

Флавоноиды (катехин, дигидрокверцетин, флоретин (рис. 1B, 1C, 1D), растворенные в 70%-ном этаноле, кверцетин (рис. 1A) – в ДМСО) добавляли в суспензию готовых липосом, встряхивая на шейкере или вортексе. Объем вносимого растворителя составлял не более 0,1%.

Плавление липидов в липосомах для термического анализа осуществляли с использованием дифференциального адиабатного сканирующего микрокалориметра ДАСМ-4 (ИБП РАН, г. Пущино, Россия). Скорость прогрева составляла 1 К/мин [10]. Температуры фазового перехода (гелевый в жидкокристаллический (Tm) или бислой в небислойную фазу (Thex)) определяли как температуру пикового максимума на термограммах сканирования липосом. Изменение энтальпии фазовых переходов (ΔH) получали по площадям под пиками переходов.

missing image file

Рис. 1. Флавоноиды: A – кверцетин, B – дигидрокверцетин, C – катехин, D – флоретин

Результаты исследования и их обсуждение

На рисунках 2 и 3 представлены термограммы плавления липидов ФЭ в липосомах, характеризующихся фазовыми переходами с максимумами температуры 25,1oС (рис. 2а) и 69,4 оС (рис. 3а) в условиях измерения, приведенных в подписях к рисункам.

missing image file

Рис. 2. Термограммы плавления липидов в липосомах из ФЭ (2 мг/мл) в диапазоне температуры плавления бислоя липосом – а. В присутствии флавоноидов (4,0х10-4М): катехин – b, кверцетин – c, дигидрокверцетин – d, флоретин – e. Среда измерения: 10 мМ Трис-HCl, рН 7,4

Два температурных диапазона (рис. 2 и рис. 3), в которых наблюдаются фазовые переходы, представлены отдельно друг от друга. В интервале температур 15–30oС (рис. 2а) действие исследуемых флавоноидов мало чем отличалось от аналогичного процесса для липосом из димиристоилфосфатидилхолина (ДМФХ) [11]. Катехин оказывал слабое влияние на плавление бислоя, тогда как действие кверцетина и дигидрокверцетина на бислой мембраны сводилось к уменьшению высоты перехода на термограммах (рис. 2c, 2d). Наиболее существенное влияние оказывал флоретин (рис. 2e), в присутствии которого снижалась энтальпия перехода с 4,39 kcal/mol до 3,52 kcal/mol, в то время как его полуширина, наоборот, увеличилась почти в 7 раз (табл. 1). Ниже в таблице 1 приведены численные значения термодинамических параметров бислойной структуры термотропных фазовых переходов ФЭ, термограммы которых представлены на рисунке 2.

missing image file

Рис. 3. Термограммы плавления липидов в липосомах из ФЭ (2 мг/мл) в диапазоне температуры перехода из бислоя в гексагональную фазу HII – a. В присутствии флавоноидов (4,0х10-4М): катехин – b, кверцетин – c, дигидрокверцетин – d, флоретин – e. Среда измерения: 10 мМ Трис-HCl, рН 7,4

Таблица 1

Термодинамические параметры фазовых переходов ФЭ

Флавоноид

∆H, kcal/mol

T, oC

T1/2, oC

∆Cp, kcal/mol/K

ФЭ (контроль)

4,39

25,1

1.0

3,29

ФЭ + катехин

5,77

25,5

1,0

4,02

ФЭ + дигидрокверцетин

4,86

24,5

1,6

2,13

ФЭ + кверцетин

5,07

25,3

2,1

1,58

ФЭ + флоретин

3,52

22,4

7,4

0,44

Таблица 2

Термодинамические параметры фазовых переходов ФЭ

Флавоноид

∆H, kcal/mol

T, oC

T1/2, oC

∆Cp, kcal/mol/K

ФЭ (контроль)

0,49

69,4

1,3

0,27

ФЭ + катехин

0,45

71,7

2,9

0,12

ФЭ + дигидрокверцетин

0,32

70,2

4,2

0,06

ФЭ + кверцетин

0,52

69,6

2,8

0,15

ФЭ + флоретин

0,43

69,0

1,8

0,17

В интервале температур 65–80oС (рис. 3) действие молекул флоретина (рис. 3e) было наименее выраженным и заключалось в снижении максимума температуры перехода.

Положение максимума температуры перехода в присутствии молекул катехина увеличивалось на 2,5оС, в 2 раза увеличилась энтальпия (рис. 3b) и значительно увеличивалась полуширина перехода (табл. 2). Ниже в таблице 2 приведены численные значения термодинамических параметров гексагональной структуры термотропных фазовых переходов ФЭ, термограммы которых представлены на рисунке 3.

В присутствии дигидрокверцетина (рис. 3d) понижалась энтальпия перехода с 0,49 kcal/mol до 0,32 kcal/mol. Несмотря на существенное изменение формы термограммы плавления липида в присутствии кверцетина (рис. 3c), значение энтальпии перехода почти не изменилось. Таким образом, исследованные молекулы разного класса из обширной группы флавоноидов по-разному действуют на фазовые переходы мембраны из ФЭ как в диапазоне температуры плавления бислоя, так и в области перехода в небислойную гексагональную фазу HII.

Молекулы флавоноидов, использованные в работе, отличаются структурой (рис. 1), следовательно, и сродством, и местом локализации в липиде. Во многих случаях молекулы флавоноидов расположены близко к полярным группам липидов [2, 12], однако в зависимости от структуры молекул расположение может варьироваться. Изменение максимума температуры плавления и формы кривых термограмм указывает на способность флавоноидов инициировать гетерогенность липидного бислоя. В частности, как отмечалось выше, флавоноиды индуцируют сегментарное упорядочение в мембране [8]. Аналогичные изменения фазового состояния липидов могут происходить и в клеточных мембранах, что способно приводить к изменению баланса между липидами и повлиять на функционирование некоторых мембранных белков. Кроме того, эти изменения могут влиять и на процессы экзоцитоза и слияния мембран внутри клетки.

Выводы

1. Кверцетин и дигидрокверцетин снижают температуру фазового перехода фосфатидилэтаноламина, происходящего при 25oС, в меньшей степени, чем халкон флоретин. Катехин также снижает температуру плавления бислоя, но повышает температуру перехода из бислоя в гексагональную HII фазу.

2. Флоретин значительно изменяет термодинамические параметры плавления бислоя, но слабо действует на переход в гексагональную HII фазу.