Рак вульвы является заболеванием весьма агрессивным, так как в силу своей анатомо-топографической особенности часто рецидивирует и рано метастазирует. По данным литературы частота рецидивирования рака вульвы составляет от 30 % до 60 %. Несмотря на визуальную доступность органа к осмотру более половины больных поступают для лечения с III-IVстадиями заболевания, что затрудняет возможность проведения адекватной терапии, в связи с чем имеется низкая эффективность лечения и 5-летняя выживаемость больных раком вульвы не превышает 50 % [3, 8, 10].
Патогенетическая роль свободнорадикальных процессов в возникновении и развитии онкозаболеваний в настоящее время общепризнана. Известно, что на разных этапах злокачественной прогрессии происходят фазные изменения свободнорадикального окисления и антиокислительной активности как в самой опухоли, так и в других органах и тканях, в первую очередь в крови. В связи с этим, исследование окислительного метаболизма в крови больных раком вульвы может дать дополнительную информацию об особенностях функционального состояния организма в зависимости от клинического течения заболевания [6, 7, 12].
Цель исследования. Провести сравнительное исследование интенсивности свбоднорадикального окисления и активности антиоксидантной системы защиты в крови больных раком вульвы на различных этапах развития данной патологии (первичный рак, состояние ремиссии и рецидив заболевания).
Материалы и методы исследования
Исследование состояния свободнорадикальных окислительных процессов в крови было проведено у 71 женщины раком вульвы I–IV стадии (I –22 %, II – 62 %, III –15 %, IV –1 %) в возрасте от 37 до 87 лет (средний возраст составил 66,7±1,3 лет, 88 % женщин находились в возрасте 51–80 лет) проходивших лечение в стационаре и находящихся на мониторинге в ФГБУ «РНИОИ» Минздрава РФ. Из них на момент обследования у 30 был выявлен первичный рак вульвы, у 21 – рецидив рака вульвы, 20 находились в третьей клинической группе в длительной ремиссии – от 3 до 13 лет. Контрольную группу (группу доноров) составили 30 женщин без онкопатологии в возрасте от 34 до 73 лет (средний возраст 58,4±2,7 лет).
Для оценки интенсивности свободнорадикального окисления в плазме крови исследовали светосумму быстрой вспышки перекись-индуцированной люминолзависимой хемилюминесценции (ХЛ) [11], содержание продуктов реакции с тиобарбитуровой кислотой (ТБК-активных соединений) в пересчете на концентрацию малонового диальдегида (МДА), содержание карбонильных производных аминокислотных остатков, характеризующих окислительную модификацию белков (ОМБ), по методу R.L. Levin в модификации Е.Е. Дубининой. Индуцированную ОМБ стимулировали реактивом Фентона. Продукты реакции регистрировали спектрофотометрически при λ 370 нм. Состояние ферментативного звена антиоксидантной системы оценивали в плазме и в эритроцитах крови, определяя активность ферментов: каталазы, супероксиддисмутазы СОД, глутатионпероксидазы ГПО [1,5]. Структурно-функциональное состояние мембран эритроцитов оценивали с использованием метода флуоресцентных зондов [4]. Содержание церулоплазмина определяли на биохимическом анализаторе COBAS INTEGRA 400 (Roche) иммунотурбидиметрическим методом.
Статистическую обработку результатов проводили с использованием пакета программ Statistika 6.0, используя критерии Стьюдента и Вилкоксона-Манна-Уитни. Различия считали статистически достоверными при p<0,05 или имеющими тенденцию к достоверности при 0,1>р>0,05.
Результаты исследования и их обсуждение
При изучении окислительного метаболизма в плазме крови больных раком вульвы было обнаружено, что светосумма перекись-индуцированной люминолзависимой хемилюминесценции, отражающей интенсивность генерации супероксид-анион радикала (О2∙−) и гидроксильного радикала (НО∙) существенно превышала норму (табл. 1).
Таблица 1
Состояние свободнорадикальных процессов и антиоксидантной системы в плазме крови больных раком вульвы
|
Показатель |
Группа |
|||
|
Контрольная (доноры) n=30 |
Первичный рак вульвы n=30 |
3 клиническая группа n=20 |
Рецидив n=21 |
|
|
Каталаза, мкМ Н2О2/мин. |
34,76±2,35 |
48,58±2,72 р1<0,001 |
52,31±4,9 р1<0,001 |
47,98±3,59 р1<0,01 |
|
МДА, нМ/мл плазмы |
290,8±27,3 |
581,8±46,6 р1<0,001 |
450,1±43,3 р1<0,001 |
623,0±61,5 р1<0,001 р3<0,05 |
|
Церулоплазмин, г/л |
0,295±0,023 |
0,340±0,027 |
0,301±0,025 |
0,358±0,025 0,1>р1>0,05 |
|
Светосумма хемилюминесценции плазмы крови, имп./6 сек. |
3950,4±375,2 |
11014,7±1576,8 р1<0,001 р3<0,01 |
5812,5±603,4 р1<0,01 |
12364,8±1999,0 р1<0,001 р3<0,01 |
|
ОМБ 370 нмспонт., мкМ/мг белка |
23,58±2,39 |
28,24±2,34 |
20,91±1,89 |
25,86±2,34 |
|
ОМБ 370 нм инд., мкМ/мг белка |
1080,0±95,1 |
939,7±42,2 р3<0,05 |
698,6±57,9 р1<0,01 р2<0,05 |
910,01±69,71 р3<0,05 |
Примечание.достоверность различий между группами: р1 – по сравнению с контрольной группой, р2 – по сравнению с группой с первичным раком вульвы, р3 – по сравнению с 3 клинической группой.
У больных первичным раком вульвы этот показатель был выше по сравнению с уровнем доноров в 2,8 раза, а у больных с рецидивом – в 3,1 раза (p<0,001). При этом следует отметить, что значение данного показателя у больных 3 клинической группы хотя и превышало контрольные значения в 1,5 раза, но было значительно ниже, чем у больных первичным раком вульвы и с рецидивом в 1,9 и 2,1 раза соответственно. Следовательно, рецидивирование рака вульвы происходит на фоне интенсификации процессов генерации свободных радикалов в плазме крови.
Защиту от повреждающего действия активных форм кислорода осуществляют в первую очередь ферменты-антиоксиданты. У всех обследованных больных раком вульвы отмечено увеличение активности каталазы: у больных с первичным раком вульвы и рецидивом на 39,8 и 38,0 % по сравнению с контролем, а у больных 3 клинической группы – на 50,5 % (табл. 1). Мы полагаем, что активация этого антиоксидантного фермента происходит в ответ на избыточную продукцию свободных радикалов в плазме крови больных раком вульвы и носит компенсаторный характер. Содержание основного антиоксиданта плазмы крови церулоплазмина было повышено на 21,4 % только у больных с рецидивами рака вульвы. В связи с тем, что основными функциями церулоплазмина являются регулирование обмена меди в крови и других тканях, а также участие в иммобилизации сывороточного железа [7], такая картина может свидетельствовать об активации метаболизма меди и железа, и, по всей видимости, способствует развитию рецидива.
Однако, несмотря на данный факт, исследование интенсивности процессов перекисного окисления липидов в плазме крови выявило их активацию во всех исследуемых группах больных раком вульвы, что проявилось в повышении содержания МДА. У больных с первичным раком вульвы значения данного показателя в 2 раза превышали соответствующие величины контрольной группы, а у больных с рецидивом были в 2,1 раза выше относительно нормы и на 38 % по сравнению со значениями у больных 3 клинической группы. Следует отметить, что у больных в ремиссии прирост содержания МДА был наименьшим – на 54 % выше уровня доноров.
В то же время изучение перекисного окисления белков по уровню продуктов окисления белковых молекул плазмы крови – карбонильных производных не выявило достоверных изменений в содержании спонтанно окисленных аминокислотных остатков. Полученные нами результаты могут быть обусловлены активацией каталазы, о чём в литературе имеются данные, указывающие на сильную обратную корреляцию между накоплением карбонильных групп и активностью каталазы [13].
Исследование металлкатализируемой ОМБ выявило достоверное снижение уровня карбонильных производных белков у больных 3 клинической группы как по сравнению с уровнем у доноров, так и у больных первичным раком вульвы и с рецидивом – на 35,3, 25,7 и 23,2 % соответственно (табл. 1). Поскольку уровень металлкатализируемой ОМБ рассматривается как величина, по которой можно судить о количестве субстрата окисления (доступных легко окисляемых групп) и возможности его вовлечения в этот процесс (доступных сайтов связывания ионов металлов) и, следовательно, об устойчивости системы к оксидативному стрессу [2,14], то более низкое значение показателя металлкатализируемого ОМБ у больных 3 клинической группы свидетельствует о меньшей окисляемости белков и большей устойчивости к окислительному повреждению, что в свою очередь может являться следствием конформационных изменений белковых молекул у больных этой группы.
Результаты исследования состояния антиоксидантной системы в эритроцитах крови больных раком вульвы представлены в табл. 2.
Таблица 2
Состояние антиоксидантной системы в эритроцитах крови больных раком вульвы
|
Показатель |
Группа |
|||
|
Контрольная (доноры) n=30 |
Первичный рак вульвы n=30 |
3 клиническая группа n=20 |
Рецидив n=21 |
|
|
СОД, ед. актив./мг Hb |
500,8±16,4 |
423,4±21,8 р1<0,01 |
424,2±28,9 р1<0,05 |
410,6±18,2 р1<0,001 |
|
Каталаза, мкМ Н2О2/мин.×мгHb |
135,5±4,1 |
128,5±6,0 |
126,5±4,8 |
129,3±8,5 |
|
ГПО, МЕ/мг Hb |
243,5±23,0 |
369,0±24,1 р1<0,001 |
349,3±29,5 р1<0,05 |
364,1±24,8 р1<0,001 |
|
СОД/Каталаза |
3,75±0,12 |
3,29±0,17 |
3,30±0,16 |
3,12±0,22 |
|
СОД/ГПО |
2,50±0,23 |
1,10±0,08 р1<0,001 |
1,07±0,09 р1<0,001 |
1,33±0,19 р1<0,01 |
|
Каталаза/ГПО |
0,726±0,092 |
0,363±0,029 р1<0,01 |
0,371±0,030 р1<0,001 |
0,380±0,041 р1<0,05 |
|
МДА, нМ/мл 1 % гемолизата |
521,0±33,9 |
755,0±70,7 р1<0,05 |
519,4±41,3 р2<0,01 |
747,3±72,8 р1<0,01 р3<0,01 |
Примечание.достоверность различий между группами: р1 – по сравнению с контрольной группой, р2 – по сравнению с группой с первичным раком вульвы, р3 – по сравнению с 3 клинической группой.
Было выявлено снижение активности СОД у больных раком вульвы: в группе первичных больных на 15,4 %, у больных 3 клинической группы на 15,3 %, у больных с рецидивом–на18,0 % по сравнению с уровнем в контроле (p<0,05–p<0,001). Активность каталазы, функционирующей в каскаде с СОД, во всех группах обследованных больных достоверно не отличалась от значений в группе здоровых женщин. В отличие от каталазы активность другого перекись устраняющего фермента – ГПО во всех группах больных раком вульвы была достоверно выше, чем в группе доноров: у первичных больных на 51,5 %, у больных 3 клинической группы на 43,4 %, у больных с рецидивом на 49,5 %.
Анализ динамики коэффициентов, характеризующих сбалансированность работы антиоксидантных ферментов эритроцитов, показал, что, несмотря на снижение активности СОД, достоверных изменений значений коэффициента СОД/Каталаза во всех группах больных выявлено не было, что свидетельствует о стабильности в работе каскада ферментов первой линии антиоксидантной защиты. При этом происходило достоверное снижение значения коэффициентов СОД/ГПО и Каталаза/ГПО во всех группах больных по сравнению с уровнем у здоровых женщин: у первичных больных раком вульвы на 56,0 и 50,0 %, соответственно, в 3 клинической группе на 57,2 и 48,9 %, в группе с рецидивом на 46,8 и 47,6 % (за счет повышения активности ГПО), что свидетельствует о несбалансированном функционировании данных ферментов и может привести к активации процессов ПОЛ.
Действительно, было выявлено увеличение содержания МДА (продукта перекисного окисления липидов) в эритроцитах первичных больных и больных с рецидивом рака вульвы: в среднем на 43–45 % по сравнению с уровнем в контроле и по сравнению с уровнем в группе с ремиссией (p<0,05–p<0,01) (табл. 2).
Известно, что основная роль в защите эритроцитов от действия активных форм кислорода как в норме, так и при развитии окислительного стресса, принадлежит ферментам первой линии антиоксидантной защиты, снижение активности которых, на фоне усиления работы ГПО, может служить показателем низкой резистентности эритроцитарных мембран к переокислению. При исследовании состояния мембран эритроцитов у больных раком вульвы было обнаружено увеличение их текучести по сравнению с уровнем у доноров (табл. 3). У больных первичным раком вульвы отмечено увеличение текучести мембран в липидном бислое на 19,7 % по сравнению с контрольной группой (p<0,05). У больных с первичным процессом текучесть мембран эритроцитов увеличивалась не только в липидном бислое, но и в зоне белок-липидных контактов на 17,9 и 18,0 %, соответственно (p<0,05). В группе больных с рецидивом увеличение данного показателя было максимально выраженным среди всех больных раком вульвы: увеличение составило 22,2 и 30,2 %, соответственно, в зоне белок-липидных контактов и в липидном бислое (p<0,05–p<0,01).
Таблица 3
Структурно-функциональное состояние мембран эритроцитов крови больных раком вульвы, у.е. опт.плотности
|
Группа |
Текучесть мембран эритроцитов |
Полярность |
Погруженность |
|
|
Белок-липидные контакты |
Липидный бислой |
|||
|
Контрольная группа n=30 |
0,442±0,024 |
0,305±0,017 |
1,423±0,014 |
0,198±0,008 |
|
Первичный рак вульвы n=30 |
0,521±0,028 0,1>р1>0,05 |
0,365±0,013 р1<0,05 |
1,454±0,012 |
0,227±0,014 р1<0,05 |
|
3 клиническая группа n=20 |
0,497±0,022 |
0,360±0,016р1<0,05 |
1,456±0,014 |
0,194±0,018 р2<0,05 |
|
Рецидив n=21 |
0,540±0,031р1<0,05 |
0,397±0,026р1<0,01 |
1,483±0,017р1<0,05 |
0,232±0,015 р1<0,05 р3<0,05 |
Примечание.достоверность различий между группами: р1 – по сравнению с контрольной группой, р2 – по сравнению с группой с первичным раком вульвы, р3 – по сравнению с 3 клинической группой.
Надо отметить, что кроме текучести мембран эритроцитов, постепенно нарастала их полярность, достигая у больных с рецидивом рака вульвы хоть и незначительного, но достоверного увеличения на 4,2 % (p<0,05).
Отмечено достоверное изменение показателя погруженности белков в липидный матрикс мембран: у больных первичным раком вульвы данный показатель был достоверно выше значений у здоровых женщин на 14,6 %, (p<0,05), у больных 3 клинической группы не отличался от нормы, а у больных с рецидивом отмечалось возрастание погруженности белков на 17,2 % по сравнению с уровнем контрольной группы и на 19,6 % по сравнению со значениями в 3 клинической группе (p<0,05).
Известно, что текучесть характеризует способность мембран реагировать на происходящие в организме нарушения, в том числе и на развитие злокачественного процесса. Причиной увеличения текучести липидного бислоя может стать усиление процессов свободнорадикального окисления липидов мембран, их взаимодействие с продуктами ПОЛ, изменение липидного состава мембран. Поскольку липиды мембран формируют среду для функционирования мембранных белков, то нарушение структуры липидного бислоя приводит к нарушению конформации связанных с ним белков, повышению их агрегации или фрагментации, что способствует увеличению текучести в зоне белок-липидных контактов, погруженности белков в липидный матрикс и, как следствие, снижению их функциональных возможностей, в том числе рецепторного аппарата [9].
При индивидуальном анализе погруженности белков в липидный матрикс в эритроцитах крови больных 3 клинической группы, находившихся на клиническом наблюдении, выяснилось, что увеличение данного показателя по сравнению со значением в предыдущей точке мониторинга предшествует клиническому проявлению рецидива рака вульвы.
Заключение
Таким образом, сравнительное исследование свободнорадикальных окислительных процессов в крови больных раком вульвы показало, что при достижении длительной ремиссии происходит снижение интенсивности свободнорадикальных процессов и перекисного окисления липидов, восстановление структурно-функционального состояния мембран эритроцитов.
При рецидивировании рака вульвы происходят нарушения метаболизма, подобные тем, что наблюдаются при первичном процессе. Отмечается усиление интенсивности генерации свободных радикалов в плазме крови, несбалансированность в работе антиоксидантных ферментов, что проявляется повышением активности каталазы и увеличением содержания церулоплазмина в плазме, снижением активности супероксиддисмутазы и существенным усилением активности глутатионпероксидазы в эритроцитах. Однако это не приводит к компенсации процессов липопероксидации, о чем свидетельствует значительное увеличение содержания продуктов перекисного окисления липидов, нарушения структурно-функционального состояния мембран эритроцитов.