Scientific journal

International Journal of Applied and fundamental research

ISSN 1996-3955

ИФ РИНЦ = 0,593

Введение

Одно из перспективных направлений в фармакологии – создание новых лекарственных форм или композиций адресного действия с заданными фармакокинетическими свойствами и содержанием в них субстанций, имеющих минимальные побочные эффекты [1, 3, 4, 6]. К лекарственным средствам нового поколения относят композиционные системы в корпускулярных контейнерах с направленной доставкой в клетки, к которым относятся липосомы, а также высокомолекулярные полимерные носители лекарственных веществ (белки, полисахариды, их комплексы с различными субстанциями и др.) [1, 2, 7]. Неослабевающий интерес к липосомам обусловлен их относительной химической инертностью, универсальностью, биосовместимостью, биодеградируемостью [1, 5, 9]. Разработка новых композиционных корпускулярных носителей предполагает обязательное проведение исследований по их биосовместимости и цитотоксичности в отношении клеток-мишеней при включении в них активно действующих лекарственных средств. Ранее нами было показано [7, 4, 9], что липосомы и декстразиды, синтезированные в результате конъюгации окисленных декстранов и гидразида изоникотиновой кислоты, могут представлять интерес как перспективное противотуберкулезное средство для лечения внутриклеточно персистирующей туберкулезной инфекции – M. tuberculosis, в связи с их накоплением в фаголизосомах – месте их персистенции, что способствует адресному воздействию на микобактерии, с другой – существенно снижает гепатотоксические и общетоксические осложнения. Однако, цитотоксические эффекты липосом, содержащих декстразид, в отношении фагоцитирующих их клеток макрофагальной системы ( место персистенции M. tuberculosis) не были изучены.

Целью настоящего исследования было изучение биосовместимости липосом, содержащих декстразид с М.м. 40 кДа, и макрофагов, по степени проявления цитотоксических эффектов липосомальной композиции в зависимости от их концентрации в культурах и времени культивирования.

Материалы и методы исследования

Исследование биосовместимости липосом, содержащих декстразид с М.м. 40 кДа – конъюгат гидразида изоникотиновой кислоты с модифицированным декстраном [7], проводили in vitro на макрофагах (МФ), выделенных из перитонеального транссудата мышей-самцов линии BALB/c 2-х месячного возраста, с массой тела 21-22 гр., полученных из питомника Института клинической иммунологии СО РАМН (г. Новосибирск, Россия). Перитонеальные МФ получали после выведения животных их эксперимента путем дислокации позвонков в шейном отделе под легким эфирным наркозом. Клетки из перитонеального транссудата эксплантировали в культуру и культивировали при 370 C в пластиковых чашках Петри (40 мм) в течение 3-х часов на покровных стеклах для прикрепления МФ (106 клеток в 1,5 мл среды 199, содержащей 10% сыворотки эмбрионов коров). Через 3 часа неадгезированные клетки смывали средой для культивирования. Полученные первичные культуры МФ культивировали в течение 24 часов с целью их адаптации для последующих экспериментальных воздействий.

Для получения липосом, содержащих декстразид (ЛПД), 20 мг фосфатидилхолина (Sigma, USA) помещали в 2 мл раствора декстразида М.м. 40 кДа (в 0,9 % NaCl) в концентрации 10000 мкг/мл, полученного на основе окисленного декстрана с максимальной степенью окисления (при содержании гидразида изоникотиновой кислоты – 5 мг/мл), и оставляли набухать при температуре 4 - 6º С на 24 часа [7, 8]. Для получения липосом заданной размерности липидную суспензию многократно продавливали через ацетат-целлюлозные фильтры (Sartorius, Germany), первоначально через фильтр с диаметром пор 0,8 мкм, затем через фильтр с диаметром пор 0,45 мкм и на завершающем этапе через фильтр с диаметром пор 0,2 мкм. В результате получали фракции липосом в размерных диапазонах 0,15-0,20 мкм и 0,20-0,45 мкм [7, 9], содержащие декстразид внутри жидкой фазы липосом в концентрации 10000 мкг/мл. При таком способе получения липосом концентрация «свободного» (вне липосом) декстразида в исходной суспензии была эквивалентна его концентрации в липосомах. Включение декстразида в липосомы в составе жидкой фазы верифицировали в дополнительном методическом эксперименте при использовании вместо декстразида его химического «аналога» - окисленного декстрана с М.м. 40 кДа, меченного флуоресцеином. При этом отмечено, что при разбавлении таких липосом в 100 и более раз интенсивность их флуоресценции не снижается, что свидетельствует об их стабильности и сохранении декстрана во внутренней жидкой фазе липосом в той концентрации, которая была в рабочем растворе при их получении, т.е. 10000 мкг/мл.

Эффекты, характеризующих биосовместимость ЛПД проводили по их влиянию на жизнеспособность перитонеальных МФ [7, 8]. Исследовали in vitro цитотоксические эффекты ЛПД на МФ в зависимости от размеров липосом (0,15-0,20, 0,20-0,45 мкм), концентрации липосом в культуральной среде, соответствующей эквиваленту концентрации фосфатидилхолина (50, 100 и 150 мкг/мл), концентрации в среде свободного декстразида (50, 100 и 150 мкг/мл) и времени инкубации МФ с ЛПД (48 и 72 час). Дополнительно исследовали цитотоксические эффекты «пустых» липосом (ЛП) различной размерности (0,15-0,20, 0,20-0,45 мкм), соответствующей эквиваленту концентрации фосфатидилхолина (50, 100 и 150 мкг/мл), и эффекты «свободного» декстразида, в той концентрации, которая оставалась в суспензиях с ЛПД после их соответствующего разведения. Жизнеспособность (% живых перитонеальных клеток) в культурах оценивали при помощи витальной окраски трипановым синим [7, 8]. Подсчитывали долю (в процентах) макрофагов, окрашенных трипановым синим. В качестве общего контроля служили интактные культуры перитонеальных макрофагов.

Статистическую обработку результатов исследования проводили методами вариационной статистики. Данные представлены в виде средних арифметических величин и ошибок средних величин. Вероятность достоверности различий сравниваемых средних величин осуществляли с помощью непараметрического критерия Манна-Уитни. Для статистической обработки результатов исследования использовали пакет прикладных программ «Statistica 7.0».

Результаты и обсуждение

Согласно данным, представленным в таблице 1, культивирование МФ в среде, содержащей ЛП c размерностью 0,15-0,20 мкм, не приводит к заметным цитотоксическим эффектам даже через 72 часа после их внесения в культуры клеток. При культивировании МФ в среде, содержащей суспензии ЛП размерностью 0,20-0,45 мкм, отмечено незначительное возрастание количества нежизнеспособных МФ через 72 часа культивирования в среде с ЛП при использовании максимальной концентрации ЛП, соответствующей эквиваленту концентрации фосфатидилхолина 150 мкг/мл. Таким образом, в предварительных экспериментах было показано, что в исследуемой экспериментальной модели ЛП с размерностью 0,15-0,20 и 0,20-0,45 мкм обладают высокой биосовместимостью в отношении культивируемых in vitro МФ.

Таблица 1

Результаты исследования in vitro влияния «пустых» липосом на жизнеспособность макрофагов in vitro

Примечание. Различия представлены в виде: * Р<0,05 (при сравнении показателей у макрофагов в «Контроле» с показателями в «экспериментальных» группах культур макрофагов, инкубированных с липосомами). «Контролем» служили макрофаги, культивируемые в среде для культивирования, не содержащей липосомы. Обозначения: ФХЛ экв. – весовой эквивалент фосфатидилхолина.

В таблице 2 представлены результаты исследования цитотоксических эффектов «свободного» декстразида (без липосом), в концентрациях, эквивалентных концентрациям декстразида, содержащихся в среде с тестируемыми разведениями липосом: 50, 100 и 150 мкг/мл. Показано, что цитотоксическое действие декстразида начинало проявляться при его концентрации в среде для культивирования 100 мкг/мл через 48 часов после его внесения, достигая еще больших значений при концентрации 150 мкг/мл. При увеличении времени культивирования до 72 часов цитотоксический эффект декстразида несколько возрастал при концентрации 150 мкг/мл.

Таблица 2

Результаты исследования in vitro влияния «свободного» декстразида на жизнеспособность макрофагов in vitro

Примечание. Различия представлены в виде: * Р<0,05 (при сравнении показателей у макрофагов в «Контроле» с показателями в «экспериментальных» группах культур макрофагов, инкубированных с декстразидом). «Контролем» служили макрофаги, культивируемые в среде для культивирования, не содержащей декстразид.

Липосомы, «нагруженные» декстразидом (ЛПД), в размерном диапазоне 0,15-0,20 мкм при концентрациях, соответствующих эквивалентам концентрации фосфатидилхолина 100-150 мкг/мл и концентрациям «свободного» декстразида в культуральной среде 100-150 мкг/мл обладали заметным цитотоксическим действием (табл. 3). Напротив, цитотоксичность ЛПД в размерном диапазоне 0,20-0,45 мкм при аналогичных концентрациях ЛПД и свободного декстразида (100-150 мкг/мл) не превышала таковую «пустых» липосом такой же размерности и была ниже, чем «свободного» декстразида в соответствующих концентрациях (100-150 мкг/мл). Среда для культивирования, содержащая и «свободный» и внутрилипосомальный декстразид, обладала большей цитотоксичностью видимо в связи с адгезией на поверхности липосом небольшого количества декстразида, а также его попадания в «смесь» липосом и декстразида. Причем следует учитывать, что более мелкие липосомы имели большую суммарную поверхность в равной единице объема, чем более крупные.

Таким образом, показано, что ЛПД в размерном диапазоне 0,20-0,45 мкм обладали менее выраженными цитотоксическими свойствами, чем ЛПД в размерном диапазоне 0,15-0,20 мкм. Цитотоксические свойства ЛПД с размерностью 0,15-0,20 мкм проявлялись через 48 часов культивирования при их концентрации, соответствующей эквивалентам концентрации фосфатидилхолина 100 мкг/мл, и концентрации «свободного» декстразида в культуральной среде 100 мкг/мл. Цитотоксические свойства ЛПД с размерностью 0,20-0,45 мкм проявлялись через 72 часа культивирования при их концентрации, соответствующей эквивалентам концентрации фосфатидилхолина 150 мкг/мл, и концентрации «свободного» декстразида в среде 150 мкг/мл.

Таблица 3

Результаты исследования in vitro влияния на жизнеспособность макрофагов среды для культивирования, содержащей липосомы с декстразидом и «свободный» декстразид

Примечание. Различия представлены в виде: * Р<0,05 (при сравнении показателей у макрофагов в «Контроле» с показателями в «экспериментальных» группах культур макрофагов, инкубированных в среде, содержащих липосомы с декстразидом, и «свободный» (вне липосом) декстразид. «Контролем» служили макрофаги, культивируемые в среде для культивирования, не содержащей декстразид с липосомами. Обозначения: ФХЛ экв. – весовой эквивалент фосфатидилхолина.

Ранее было показано, что цитопатогенный эффект гидразида изоникотиновой кислоты может быть снижен при конъюгации гидразида изоникотиновой кислоты с окисленными декстраном [2]. Дестразид - конъюгат гидразида изоникотиновой кислоты с модифицированным декстраном обладает свойством накапливаться в клетках СМФ, РЭС, а также в гепатоцитах. Если придать ему свойства корпускулярности, то это исключает его захват клетками эндотелия синусоидов печени и гепатоцитами. Это существенно понизит его гепатотоксичность и повысит эффективность в отношении микобактерий туберкулеза, персистирующих в макрофагах [2, 6, 7].

В представленной нами работе цитотоксическое действие декстразида в отношении МФ проявлялось при концентрации 150 мкг/мл. Вместе с тем, внутри ЛП в составе ЛПД концентрация декстразида достигала 10000 мкг/мл, а цитотоксический эффект ЛПД проявлялся только при достижении их концентрации 100 мкг/мл в эквиваленте фосфатидилхолина. Таким образом, установлено, что заключение декстразида в ЛПД значительно снижает цитотоксические свойства декстразида, но повышает его микробицидность в отношении внутриклеточно персистирующих микобактерий туберкулеза.

Ранее нами было показано, что фагоцитозная активность МФ в отношении ЛПД зависит от их размеров [4, 9]. Показано, что количество ЛПД, фагоцитированных МФ, возрастает при уменьшении размеров ЛПД. Согласно этим данным более высокую цитотоксичность ЛПД с размерами 0,15-0,20 мкм по сравнению с ЛПД 0,20-0,45 мкм можно, вероятно, объяснить более быстрым захватом ЛПД с размерами 0,15-0,20 мкм и накоплением в большем количестве в МФ за одинаковый промежуток времени. Не исключено, что испытуемое средство может отчасти решать проблему лекарственной устойчивости M. tuberculosis, персистирующих внутриклеточно, потому что декстран в составе гибридной молекулы декстразида увеличивает частоту слияния фагосом с лизосомами и создает в фаголизосоме очень высокие концентрации гидразида изоникотиновой кислоты, в тоже время его концентрация в крови может быть много меньше, чем если бы вводили в организм «чистый» гидразид изоникотиновой кислоты.

Заключение

Полученные данные указывают на то, что ЛПД, могут рассматриваться как перспективное противотуберкулезное средство для лечения внутриклеточно персистирующих и «свободных» M. tuberculosis. Результаты исследования также могут быть использованы при разработке и оптимизации новых перспективных биосовместимых контейнеров на основе липосомальных конструкций для биологически активных веществ и лекарственных препаратов с целью их адресной доставки в различные клетки и ткани-мишени, обладающие фагоцитозной активностью.

Исследование выполнено с использованием оборудования ЦКП «Современные оптические системы» на базе ФГБНУ «Научно-исследовательский институт экспериментальной и клинической медицины»