Научный журнал
Международный журнал прикладных и фундаментальных исследований

ISSN 1996-3955
ИФ РИНЦ = 0,686

МЕХАНИЗМЫ РАСПЛАСТЫВАНИЯ МЕЗЕНХИМАЛЬНЫХ СТВОЛОВЫХ КЛЕТОК КРУПНОГО РОГАТОГО СКОТА

Ковалева А.В. 1 Творогова А.В. 1 Саидова А.А. 1
1 ФГБНУ «Центр экспериментальной эмбриологии и репродуктивных биотехнологий»
В настоящее время для регенерации поврежденных тканей все шире используются мезенхимальные стволовые клетки. Способность к прикреплению и распластыванию на субстрате является фундаментальным свойством клеток, влияющим на процессы развития, органогенеза и гомеостаза организма. Распластывание клеток происходит, когда клетки прикрепляются к адгезивному субстрату за счет выдвижения тонкой ламеллиподии. Мы проанализировали процесс распластывания мезенхимальных стволовых клеток, используя виртуальную синхронизацию начала распластывания. Распластывание мезенхимальных стволовых клеток крупного рогатого скота (МСК КРС) – это нелинейный процесс, который включает в себя быструю фазу (0–10 минут) и медленную фазу распластывания (30 минут – 3 часа). В первые десять минут клетки увеличивают свою площадь в 2–4 раза, а абсолютная начальная скорость распластывания уменьшается в 6,5 раз. Распластывание существенно замедляется при подавлении роста микротрубочек. В меньшей степени процесс распластывания замедляется при ингибировании полимеризации актина. При этом нарушение полимеризации микрофиламентов способствует изменению морфологии клеток. Таким образом, динамические микротрубочки являются основным регулятором распластывания мезенхимальных стволовых клеток крупного рогатого скота.
мезенхимальные стволовые клетки
актин
микротрубочки
распластывание
1. Ровенский Ю.А., Васильев Ю.М. Морфогенетические реакции клеток и их нарушения при опухолевой трансформации. М.: Медицина, 2004. С. 376–414.
2. Bliokh Zh.L., Smolianinov V.V. Cinematics of fibroblast spreading. I. Analysis of a population. Biofizika. 1977. no. 22. P. 471–479.
3. Ganguly A., Yang H., Sharma R., Patel K.D., Cabral F. The role of microtubules and their dynamics in cell migration. J. Biol. Chem. 2012. No. 287. P. 43359–43369.
4. Dobereiner H.G., Wiggins C.H., Sheetz M.P. Quantification of cell edge velocities and traction forces reveals distinct motility modules during cell spreading. PLoS One. 2008. Vol.3. no. 11 P. e3735.
5. Wolfenson H., Iskratsch T., Sheetz M.P. Early events in cell spreading as a model for quantitative analysis of biomechanical events. Biophys J. 2014. no. 107. P. 2508–2514.
6. Etienne J., Duperray A. Initial dynamics of cell spreading are governed by dissipation in the actin cortex. Biophys J. 2011. no 101. P. 611–621.
7. Xiong Y., Rangamani P., Fardin M.A., Lipshtat A., Dubin-Thaler B., Rossier O., Sheetz M.P., Iyengar R. Mechanisms controlling cell size and shape during isotropic cell spreading. Biophys J. 2010. No. 98. P. 2136–2146.
8. Senju Y., Miyata H. The role of actomyosin contractility in the formation and dynamics of actin bundles during fibroblast spreading. J. Biochem. 2009. No. 145. P. 137–150.
9. Waterman-Storer C.M., Worthylake R.A., Liu B.P., Burridge K., Salmon E.D. Microtubule growth activates Rac1 to promote lamellipodial protrusion in fibroblasts. Nat. Cell Biol. 1999. No 1. P. 45–50.
10. Goldyn A.M., Kaiser P., Spatz J.P., Ballestrem C., Kemkemer R. The kinetics of force-induced cell reorganization depend on microtubules and actin. Cytoskeleton (Hoboken). 2010. Vol. 67. No. 4. P. 241–250.
11. Творогова А.В., Воробьев И.А. Динамические микротрубочки подавляют блэббинг и стимулируют распластывание фибробластов // Цитология. 2012. Т. 54. № 10. С. 742–753.
12. Stehbens S., Wittmann T. Targeting and transport: how microtubules control focal adhesion dynamics. J. Cell. Biol. 2012. no 198. p. 481–489.
13. Шутова М.С., Александрова А.Ю. Сравнительное исследование распластывания нормальных и трансформированных фибробластов. Роль полимеризации микрофиламентов и актин-миозинового сокращения // Цитология. 2010. Т. 52. № 1. С. 41–51.
14. Domnina L.V., Rovensky J.A., Vasiliev J.M., Gelfand I.M. Effect of microtubule-destroying drugs on the spreading and shape of cultured epithelial cells. J. Cell Sci. 1985. No. 74. P. 267–282.
15. Schofield A., Steel R., Bernard O. Rho-associated Coiled-coil Kinase (ROCK) Protein Controls Microtubule Dynamics in a Novel Signaling Pathway That Regulates Cell Migration. J. Bio. Chem. 2012. Vol.287. No. 52. P. 43620–43629.

Способность к прикреплению и распластыванию на субстрате – фундаментальное свойство клеток, влияющее на процессы развития, органогенеза и гомеостаза организма. Нарушения этих процессов влияют на скорость регенерации поврежденных тканей, иммунного ответа организма, а кроме того могут быть причиной развития опухолей [1].

В ранних работах показано, что процесс распластывания клеток на субстрате имеет линейную динамику [2], что может быть объяснено асинхронностью начала распластывания в разных клетках и гетерогенностью популяции по стадиям распластывания. Синхронизация клеток по началу распластывания позволила выявить нелинейность этого процесса. В нем выделяют 3 фазы: прикрепления (Р0), быстрого распластывания (Р1) и медленного распластывания с дальнейшей поляризацией (Р2) [3]. Первая фаза распластывания достаточно короткая, её продолжительность составляет всего несколько минут и зависит от степени адгезивности субстрата и присутствия сыворотки в среде культивирования [4]. Вторая стадия также непродолжительна, характеризуется быстрым ростом площади клетки за счет образования значительных по размерам протрузий и незначительных ретракций [5]. Третья стадия является самой продолжительной и характеризуется медленным ростом средней площади клетки, ее периодическими значительными сокращениями, а также образованием стабильных клеточных адгезий.

Распластывание клеток на субстрате начинается с выдвижения коротких плоских выростов плазматической мембраны – ламеллиподий – и зависит от скорости полимеризации актина на краю клетки [6]. Быстро увеличив свою площадь на первых стадиях распластывания, клетка поляризуется за счет формирования актомиозиновых комплексов и их сокращения [7]. Таким образом, роль актина и актомиозиновых комплексов на ранних этапах распластывания является ведущей и подтверждается в опытах с использованием их селективных ингибиторов. Латранкулин А, связываясь с мономерным актином, предотвращает его полимеризацию. Разрушение пучков актина с помощью цитохолазина D или латранкулина B приводит к потере способности клетки к поляризации, движению и переориентации при изменении направления растяжения субстрата [8].

Микротрубочки также играют существенную роль в распластывании, поляризации и последующем движении клеток. Так, растущие микротрубочки на краю клеток стимулируют формирование ламеллиподий [9]. Деполимеризация микротрубочек в распластанных и распластывающихся клетках приводит к усилению актомиозинового сокращения [10] и гипертрофии стресс-фибрилл в клетках. К таким же последствиям приводит не только полная разборка микротрубочек, но и подавление их динамической нестабильности [11]. Динамичные микротрубочки в движущихся клетках стимулируют разборку фокальных контактов [12], подавляя актомиозиновое сокращение. Таким образом, различные элементы цитоскелета обеспечивают прикрепление, распластывание и передвижение клеток по субстрату, а динамика этих процессов определяется взаимодействием системы микротрубочек и актиновых филаментов.

В настоящее время для регенерации поврежденных тканей все шире используются мезенхимальные стволовые клетки. Их культивирование и дифференцировка проводятся in vitro. Известно также, что при ряде патологических состояний наблюдаются повреждения цитоскелета и его функциональные нарушения в клетках. В связи с этим важно определить динамические свойства разных компонентов цитоскелета в распространенной in vitro модели культивирования нормальных мезенхимальных стволовых клеток КРС для разработки экспериментальных и клинических моделей заболеваний, связанных с патологиями цитоскелета.

Цель исследования: анализ процесса прикрепления и распластывания мезенхимальных стволовых клеток КРС в нормальных условиях и в условиях нарушений цитоскелета под действием селективных ингибиторов.

Материалы и методы исследования

Культура клеток

Мезенхимальные стволовые клетки крупного рогатого скота (МСК КРС) 5–7 пассажей (получены из банка Центра экспериментальной эмбриологии и репродуктивных биотехнологий, Москва, Россия) культивировали при 37 °С в атмосфере 5 % СО2, в среде DMEM/F12(1:1) с добавлением 10 % телячьей эмбриональной сыворотки (ПанЭко, Россия), гентамицина в концентрации 0,09 мг/мл, 2,5 мкг/мл амфотерицина В и 2 мМ глутамина. Для детального анализа распластывания полученную при помощи раствора трипсин-ЭДТА (ПанЭко, Россия) суспензию клеток помещали в чашки Петри. Концентрацию клеток подбирали таким образом, чтобы в ходе распластывания соседние клетки не контактировали. Прижизненные наблюдения вели при помощи системы Nikon BioStation IM-Q, изображения записывались с интервалом 1 минута в течение 3,5 часов.

Ингибиторы

Для деполимеризации микротрубочек (МТ) использовали нокодазол (Sigma-Aldrich, USA) в концентрации 1 мкМ. Для стабилизации МТ использовали 1 мкМ паклитаксела (таксол) (Sigma-Aldrich, USA). Для ингибирования полимеризации актина клетки инкубировали с 30 нМ цитохалазином Д (Sigma-Aldrich, США) или 200 нМ латрункулином Б (Sigma-Aldrich, США). Ингибитором Rho-ассоциированной киназы (ROCK) являлся 10 мкМ Y-27632 (Sigma-Aldrich, США).

Флуоресцентная микроскопия

Клетки фиксировали 2.5 % раствором глутарового альдегида на PBS (pH = 7,2) при +4 °C в течение 20 минут, трижды отмывали PBS и проводили пермеабилизацию клеток смесью 0,01 % Triton-X114 и 0.01 % Tween-20 на PBS в течение 60 минут при комнатной температуре. После трехкратной отмывки буфером клетки обрабатывали 1 % раствором боргидрида натрия. Затем клетки окрашивали первыми антителами к α-тубулину (клон DM1A, Invitrogen, США) в соотношении 1:150 при температуре 37 °C 60 минут и вторыми антителами, конъюгированными с флуоресцентным красителем Cy-2 (Invitrogen, США). Затем клетки окрашивали с помощью ActinReadyProbes 555 (Invitrogen,Thermo Fisher Scientific, США) 30 минут при комнатной температуре, для контрастирования ядер использовали флуоресцентный краситель DAPI (разведение 1:500, окрашивание в течение 10 минут при комнатной температуре). Препараты заключали в мовиол и производили съемку на инвертированном флуоресцентном микроскопе NikonEclipseTI (Nikon, Япония) с помощью фазовоконтрастного объектива планапохромат 60х/1.4 (Nikon, Япония), используя кубики светофильтров для FITC, DAPI и Texas Red. Изображения записывались на компьютер с помощью охлаждаемой КМОП камеры ORCAFlash 4.2 (Hamamatsu, Япония), управляемой программой MicroManager.

Анализ данных

Обработку и анализ полученных фильмов производили в программе ImageJ (NIH Image, США). Скорость распластывания рассчитывали как скорость увеличения площади клеток в единицу времени. Статистический анализ производили в программе SigmaPlot 3.0 (Jandel Scientific, США). Окончательную обработку изображений проводили в программе Photoshop CS (Adobe Inc., США).

Результаты исследования и их обсуждение

Распластывание – это нелинейный процесс

Для описания поведения МСК КРС при распластывании были построены кривые кинетики распластывания. Распластывание клеток на субстрате может идти двумя путями: изотропно и анизотропно. Изотропное распластывание характеризуется быстрым образованием симметричной кольцевой ламеллы, тогда как при анизотропном распластывании происходит одновременное формирование нескольких ламелл, и весь процесс идет медленнее. Для большинства МСК КРС характерно анизотропное распластывание, в некоторых клетках распластывание было изотропным.

Кинетика распластывания МСК может быть описана в виде сигмовидной кривой. Начальная скорость распластывания была максимальной в первые 10 минут (фаза Р1) (рис. 1, табл. 1). Дальнейшее распластывание (фаза Р2) проходило медленнее, и в конце первого часа общая площадь клеток увеличилась в 6,21 ± 0,82 раз по сравнению с начальными значениями (табл. 2). Далее, скорость распластывания продолжала снижаться, в то время как некоторые клетки частично поджимались. Площадь клеток к концу третьего часа увеличилась в 10,16 ± 1,62 раз относительно начальной площади (рис. 2).

kov1.tif

Рис. 1. Кинетика распластывания МСК КРС в контроле и при воздействии ингибиторов цитоскелета в интервале 0–60 минут

kov2.tif

Рис. 2. Кинетика распластывания МСК КРС в контроле и при воздействии ингибиторов цитоскелета в интервале 0–180 минут

Распластывание сопровождалось изменениями морфологии клеток. В момент прикрепления круглые клетки имели ровный контур (рис. 3), к третьему часу края клеток становились изрезанными. После детального анализа кинетики и морфологии распластывания МСК мы перешли к описанию цитоскелета. Для анализа роли МТ мы использовали 3 воздействия: полную деполимеризацию МТ в высокой концентрации нокодазола (1 мкМ), полную стабилизацию МТ в высокой концентрации паклитаксела (1мкМ) и подавление динамической нестабильности МТ сочетанием наномолярных доз нокодазола и паклитаксела. Для анализа роли актина в распластывании МСК мы использовали ингибиторы полимеризации актина (30 нМ цитохалазин Д и 200 нМ латрункулин Б). Для анализа роли миозина II мы ингибировали миозин II-фосфорилирующую киназу ROCK специфическим ингибитором Y-27632 в концентрации 10 мкМ.

kov3.tif

Рис. 3. Распластывание мезенхимальных стволовых клеток в норме и в присутствии ингибиторов цитоскелета. Масштабный отрезок – 10 мкм

Распластывание МСК при деполимеризации МТ

Клетки с деполимеризованными МТ были круглыми, распластывание сопровождалось активным блеббингом. Некоторые клетки так и не начали распластываться в течение всего времени (3,5 ч). Распластывание начиналось с образования небольших псевдоподий, которые сплющивались при прикреплении, а затем образовывали небольшие пластинки. Блеббинг не прекращался после образования ламеллы и продолжался в течение 1–3 ч (рис. 3). Процесс распластывания клеток с разрушенными МТ всегда был анизотропным и мог быть описан линейной зависимостью (рис. 2). Распластывание клеток проходило медленнее относительно контроля. К концу первого часа площадь клеток увеличилась в 2,64 ± 0,19 раз, а к концу третьего часа в 4,74 ± 0,65. Кроме того, площадь клеток под воздействием нокодазола была меньше в любой временной точке относительно контроля (табл. 2).

Таким образом, полная деполимеризация МТ приводит к возникновению блеббинга, который сопровождает выдвижение ламеллы, замедлению распластывания и отсутствию клеток с широкими ламеллами и к исчезновению быстрой фазы распластывания. Поскольку многие эффекты, связанные с отсутствием МТ, могут происходить и в случае стабилизации МТ, мы дополнительно оценивали поведение клеток после стабилизации МТ высокими дозами паклитаксела.

Распластывание МСК в условиях стабилизации МТ

При полной стабилизации МТ блеббинг начинается еще до момента прикрепления клеток и продолжается в течение всех 3,5 часов наблюдения (рис. 3). Клетки начинают распластываться изотропно, но кривая распластывания описывается линейной зависимостью (рис. 2). Через 60 минут площадь клеток увеличивается в 2,76 ± 0,39 раз. К концу третьего часа площадь клеток увеличивается в 4,78 ± 0,86 раз относительно площади в момент прикрепления. Площадь клеток под воздействием паклитаксела всегда ниже, чем в контроле (табл. 2). Скорость распластывания клеток со стабильными МТ всегда ниже, чем в контроле, однако статистически достоверно отличаются скорости только в течение первого часа распластывания (табл. 1).

Таблица 1

Скорость распластывания МСК КРС

Скорость (мкм2/мин)

Временной интервал, мин

0–10

10–20

20–30

30–60

60–120

120–180

Контроль

181 ± 24

137 ± 21

105 ± 27

82 ± 18

51 ± 16

28 ± 18

ЦитохалазинД

111 ± 19

78 ± 17

34 ± 9

45 ± 9

54 ± 10

56 ± 16

ЛатрункулинБ

242 ± 24

165 ± 26

60 ± 21

39 ± 12

17 ± 5

7 ± 9

Y-27632

190 ± 20

199 ± 27

194 ± 29

141 ± 26

29 ± 4

11 ± 5

Нокодазол

56 ± 7

41 ± 9

32 ± 5

23 ± 3

15 ± 3

30 ± 10

Таксол

87 ± 13

42 ± 9

40 ± 9

25 ± 7

33 ± 12

14 ± 5

Нокодазол + таксол

96 ± 17

33 ± 6

26 ± 5

18 ± 3

17 ± 4

3 ± 3

Таким образом, полная стабилизация МТ приводит к возникновению блеббинга, который сопровождает распластывание в течение всего времени наблюдения, значительному замедлению процесса распластывания и уменьшению площади клеток.

Поскольку выдвижение ламеллы главным образом связано с работой актомиозинового комплекса, далее мы проанализировали процесс распластывания мезенхимальных стволовых клеток при нарушении активации миозина II и при ингибировании полимеризации актина наномолярными дозами цитохалазина Д и латрункулина Б.

Распластывание в условиях подавления миозин II-зависимого каскада

В присутствии Y-27632 клетки демонстрировали нормальную кинетику распластывания в течение всего времени наблюдения. Распластывание происходило за счет формирования протрузий в нескольких направлениях, поэтому ламелла была изрезанной и рассеченной, а клетки к 3 часу приобретали звездчатую форму с многочисленными выступами, которые продолжали удлиняться.

Кинетика распластывания для всех трех фаз: P0, P1 и P2 – была почти одинаковой для клеток в присутствии Y-27632 и контрольных клеток во все моменты времени (рис. 2). Под воздействием ингибитора края клеток становились более изрезанными (через 3 ч значение округлости составляло 0,55 ± 0,05).

Таким образом, при ингибировании миозина II происходят значительные изменения в морфологии клеток. В связи с тем, что кинетика распластывания под воздействием Y-27632 не изменяется, мы дополнительно оценивали поведение клеток при подавлении полимеризации актина цитохалазином Д и латрункулином Б в наномолярных концентрациях.

Процесс распластывания при нарушении полимеризации актина

Под воздействием цитохалазина Д распластывание сопровождается активным блеббингом, который начинается до прикрепления клеток к субстрату и продолжается в течение всего времени наблюдения. В момент прикрепления клетки имеют круглую форму, но к концу первого часа клетки имеют несколько зон активности (рис. 3). Кинетика распластывания описывается нелинейно, клетки распластывались с максимальной скоростью в первые 10 минут (рис. 1, табл. 1). К концу первого часа площадь клеток увеличилась в 2,86 ± 0,37 раз. Через 3 часа площадь клеток увеличилась в 6,42 ± 1,03 раза относительно начального значения.

Под воздействием латрункулина Б блеббинг появлялся с момента прикрепления, но к концу первого часа пузырей становилось меньше. Распластывание шло анизотропно за счет образования нескольких ламелл. Через 20 минут клетки имели значительно более изрезанный контур по сравнению с контролем, за счет образования вогнутых участков (округлость 0,74 ± 0,03). В ходе дальнейшего распластывания вогнутые участки были стабильными, а ламелла продолжала выдвигаться, что способствовало увеличению изрезанности ламеллы (округлость к концу первого часа – 0,64 ± 0,04) (рис. 3). Таким образом, ингибирование полимеризации актина цитохалазином Д замедляет процесс распластывания и изменяет морфологию клеток. Ингибирование полимеризации актина латрункулином Б значительно влияет на морфологию клеток и замедляет распластывание клеток в часовом интервале.

Морфология систем цитоскелета в контрольных клетках

В контрольных клетках уже через 10 минут после прикрепления начинают полимеризоваться МТ (рис. 4). Актин тонкой полосой окаймляет клеточную ламеллу, а также распределен по всей цитоплазме (рис. 4).

kov4.tif

Рис. 4. Микротрубочки (зеленые) и актин (красный) через 10 мин после прикрепления клеток к субстрату в норме и при ингибировании цитоскелета. Масштабный отрезок – 10 мкм

Через 30 минут в клетках формируется густая радиальная сеть микротрубочек, но большинство растут дугообразно, замыкаясь в кольцевую структуру, которая не дорастает до края клеток (рис. 5).

В это же время начинает полимеризоваться актин, и по периферии клетки располагаются короткие радиально направленные пучки актиновых микрофиламентов. Через 60 минут после начала распластывания МТ образуют густую сеть, большинство МТ направлены перпендикулярно краю клетки (рис. 6). Также в клетке формируются актиновые стресс-фибриллы, которые располагаются по всей цитоплазме, а кроме того, актин распределен по самому краю клетки, образуя окаймление (рис. 6).

Цитоскелет в условиях деполимеризации МТ

Под воздействием высоких доз нокодазола МТ в клетках отсутствуют на всех стадиях распластывания (рис. 4–6). При полной разборке микротрубочек в клетках наблюдается блеббинг, актин сосредоточен в пузырях и окаймляет их (рис. 4). Через 30 минут после посадки актин также находится в блебсах, а актин распределен по цитоплазме. В отличие от контрольных клеток, стресс-фибриллы на данном этапе распластывания отсутствуют (рис. 5). Через 60 минут после посадки крупные актиновые стресс-фибриллы располагаются циркулярно, а небольшие пучки актина распределены по всей цитоплазме.

В условиях полной деполимеризации МТ содержание полимерного актина (собранного в стресс-фибриллы и в пучки) меньше, по сравнению с контролем (рис. 6).

Цитоскелет при полной стабилизации МТ

Под воздействием паклитаксела в высокой концентрации МТ образуют более редкую сеть в любой момент распластывания. Кроме того, по сравнению с контрольными клетками, МТ сильно не дорастают до края клетки (рис. 4–6). Актин, через 10 мин после посадки, располагается преимущественно в пузырях (рис. 4). Через 30 мин после начала распластывания актин сосредоточен на периферии клетки, а также выявляются скопления актина в цитоплазме. Стресс-фибриллы в отличие от контрольных клеток отсутствуют (рис. 5). Через 60 мин после начала распластывания, в клетках с полностью стабилизированными МТ формируются полигональные актиновые стресс-фибриллы (рис. 6).

Цитоскелет при ингибировании полимеризации актина

Под воздействием цитохолазина Д актин сконцентрирован в пузырях клеток, распластывание которых сопровождается активным блеббингом (рис. 4–6). Система МТ на раннем этапе распластывания (через 10 мин после посадки) такая же как и контроле. При этом во время блеббинга микротрубочки врастают в пузыри (рис. 4). Через 30 минут после посадки сеть МТ более редкая, чем в контроле. Актин сконцентрирован по клеточной периферии и рассеян по цитоплазме.

Цитоскелет в условиях подавления миозин II-зависимого каскада

При ингибировании ROCK через 10 мин после начала распластывания МТ выглядят также как и контроле. Актин сконцентрирован в блебсах клеток (рис. 4). Через 30 мин МТ образуют густую кольцевую сеть, при этом, в отличие от контрольных клеток, под воздействием Y-27632 выявляются МТ, которые сильно изгибаются и образуют петли. Актин сконцентрирован в пузырях и распределен по цитоплазме, пучки и стресс-фибриллы отсутствуют (рис. 5). Под воздействием Y-27632 стресс-фибриллы формируются на стабильных краях клетки и в цитоплазме. В отличие от контрольных клеток стресс-фибриллы в центральной части клетки отсутствуют (рис. 6).

Распластывание мезенхимальных стволовых клеток КРС на субстрате является сложным многостадийным процессом. Кинетика распластывания носит нелинейный характер и состоит из фаз быстрого (Р1) и медленного (Р2) распластывания. Эти же фазы распластывания описаны для клеток, завершивших процесс дифференцировки: клетки из эпителия почки мартышки линии Vero [11], клетки сердечного эндотелия лягушки XTH-2 [3]. Фаза быстрого распластывания МСК КРС длится всего 10 мин и характеризуется максимальной скоростью. Далее наступает фаза медленного распластывания, которая не прекращается в течение 3 ч, и характеризуется постепенным уменьшением скорости распластывания. Подавляющее большинство МСК распластывается асинхронно, поляризуется через 1–2 ч и переходит к активной миграции, что в наибольшей степени соответствует динамике клеток Vero [11]. Стоит отметить, что поляризация нормальных фибробластов в других моделях наступает гораздо позднее: через 6–8 часов после начала распластывания [1, 13].

Полная деполимеризация МТ в значительной степени подавляет процесс распластывания МСК, кривая распластывания приобретает линейный вид. Распластывание клеток сопровождается блеббингом в течение всех 3,5 ч наблюдения. По истечении 30 мин активные участки ламеллы начинают разделяться вогнутыми стабильными краями. В клетках под воздействием нокодазола существенно снижается скорость распластывания (табл. 1). Площадь клеток по истечении 3 ч оказывается меньше, чем в контрольных клетках (табл. 2). Однако для фибробластов показано, что конечная площадь распластанных клеток не изменяется при деполимеризации МТ [14]. Эффект полной стабилизации МТ проявляется похожим образом, клетки подвергаются продолжительному блеббингу. Таким образом, баланс системы МТ критичен для нормального процесса распластывания, поскольку даже частичное подавление динамики МТ приводит к значительному замедлению процесса распластывания.

Известно, что киназа ROCK ингибирует ацетилирование МТ, что способствует активной миграции и инвазии клеток [15]. Таким образом, можно предположить, что ингибирование киназы ROCK может замедлять распластывание клеток, опосредованно, через стабилизацию МТ. Однако на стадии распластывания клеток подавление киназы ROCK в значительной степени влияет только на морфологию клеток, когда клетки приобретают звездчатую форму, но не замедляет процесса распластывания (табл. 1). Кроме того, высокие дозы ингибитора на стадии распластывания МСК приводят к значительному увеличению их площади, что также было показано для фибробластов крысы [13]. Таким образом, ингибирование киназы ROCK не влияет на кинетику распластывания, но существенно изменяет морфологию клеток.

Таблица 2

Изменение площади МСК КРС в процессе распластывания

Площадь, мкм2

Временная точка, мин

0

10

20

30

60

120

180

Контроль

524 ± 73

1263 ± 151

1820 ± 204

2250 ± 269

3259 ± 430

4565 ± 620

5329 ± 851

Цитохалазин Д

788 ± 79

1243 ± 110

1563 ± 164

1701 ± 194

2253 ± 290

3571 ± 499

5058 ± 808

Латрункулин Б

599 ± 41

1583 ± 113

2256 ± 204

2501 ± 225

2986 ± 317

3387 ± 389

4236 ± 578

Y-27632

611 ± 52

1384 ± 107

2193 ± 205

2984 ± 308

4705 ± 544

5417 ± 569

5602 ± 625

Нокодазол

529 ± 37

759 ± 53

971 ± 69

1104 ± 80

1396 ± 101

1765 ± 151

2507 ± 345

Таксол

572 ± 44

926 ± 83

1100 ± 109

1263 ± 145

1576 ± 220

2389 ± 452

2734 ± 489

Нокодазол + таксол

686 ± 65

1079 ± 116

1215 ± 112

1323 ± 117

1554 ± 127

1982 ± 192

1930 ± 202

kov5.tif

Рис. 5. Микротрубочки (зеленые) и актин (красный) через 30 мин после прикрепления клеток к субстрату (стекло) в норме и при ингибировании цитоскелета. Масштабный отрезок – 10 мкм

kov6.tif

Рис. 6. Микротрубочки (зеленые) и актин (красный) через 60 мин после прикрепления клеток к субстрату в норме и при ингибировании цитоскелета. Масштабный отрезок – 10 мкм

Заключение

Выдвижение ламеллы в процессе распластывания осуществляется за счет полимеризации актина на активном краю. Наши данные показывают, что воздействие цитохалазина в низких дозах также замедляет процесс распластывания, способствует изменению морфологии клеток, но не влияет на форму кинетической кривой самого процесса. Похожий эффект проявляет воздействие другого ингибитора полимеризации актина – латрункулина Б. Таким образом, наши результаты укладываются в общие представления о функции актина в процессе распластывания.

Однако стоит отметить, что системы МТ и актинового цитоскелета тесно связаны между собой, поскольку при любом воздействии на систему МТ наблюдаются изменения в формировании актинового цитоскелета. Так, в случае полной разборки и подавлении динамической нестабильности МТ замедляется формирование стресс фибрилл. При этом полная стабилизация МТ приводит к формированию мощных стресс фибрилл. В то же время при неполном ингибировании полимеризации актина изменяется морфология системы МТ. Интересно, что при подавлении активности киназы ROCK, изменения затрагивают в большей степени актиновый цитоскелет, но также и систему МТ.

Таким образом, основную роль в процессе распластывания играют динамичные микротрубочки. Кроме того, важным фактором для правильного распластывания и поддержания морфологических характеристик МСК КРС является взаимодействие систем цитоскелета, а именно микротрубочек и актомиозинового комплекса.


Библиографическая ссылка

Ковалева А.В., Творогова А.В., Саидова А.А. МЕХАНИЗМЫ РАСПЛАСТЫВАНИЯ МЕЗЕНХИМАЛЬНЫХ СТВОЛОВЫХ КЛЕТОК КРУПНОГО РОГАТОГО СКОТА // Международный журнал прикладных и фундаментальных исследований. – 2018. – № 12-1. – С. 70-79;
URL: http://applied-research.ru/ru/article/view?id=12524 (дата обращения: 22.05.2019).

Предлагаем вашему вниманию журналы, издающиеся в издательстве «Академия Естествознания»
(Высокий импакт-фактор РИНЦ, тематика журналов охватывает все научные направления)

«Фундаментальные исследования» список ВАК ИФ РИНЦ = 1.252