Научный журнал
Международный журнал прикладных и фундаментальных исследований

ISSN 1996-3955
ИФ РИНЦ = 0,580

ИССЛЕДОВАНИЯ СПЕКТРОСКОПИЧЕСКИХ СВОЙСТВ КОДЕИНА ДЛЯ ЕГО ОПРЕДЕЛЕНИЯ В ЛЕКАРСТВЕННЫХ ПРЕПАРАТАХ И БИОЛОГИЧЕСКИХ ОБЪЕКТАХ МЕТОДАМИ ЛЮМИНЕСЦЕНЦИИ И СПЕКТРОМЕТРИИ ДИФФУЗНОГО ОТРАЖЕНИЯ

Немихин В.В. 1 Качин С.В. 2 Кутяков В.А. 1, 3 Сагалаков С.А. 2
1 КГБУЗ «Красноярское краевое бюро судебно-медицинской экспертизы»
2 ФГАОУ ВО «Сибирский федеральный университет»
3 Красноярский государственный медицинский университет имени профессора В.Ф. Войно-Ясенецкого
Представлен обзор результатов исследований спектроскопических свойств кодеина в растворах и твердой фазе, а также разработанных методик его определения в лекарственных препаратах и биологических объектах методами люминесценции и спектрометрии диффузного отражения. Свечение кодеина зафиксировано в водных растворах 0,05 M H2SO4 при длинах волн возбуждения (λвозб) и люминесценции (λлюм) 300 и 345 нм соответственно. В данных условиях возможно определение микрограммовых содержаний кодеина по его собственной люминесценции с пределом обнаружения 3 мг/дм3. В водных растворах при рН = 6–8 кодеин образует ионный ассоциат с эозином, который экстрагируется толуолом и интенсивно флуоресцирует при λвозб = 520 нм; λлюм = 550 нм. По флуоресценции экстракта ионного ассоциата возможно определение нанограммовых содержаний кодеина с пределом обнаружения 0,4 мкг/дм3. В твердой фазе кодеин образует окрашенный ионный ассоциат с реактивом Драгендорфа с максимальным значением коэффициента диффузного отражения при λ = 520 нм. Это дает возможность определять кодеин на поверхности сорбентов с пределом обнаружения 9 мг/дм3. Рассмотрены схемы пробоподготовки исследуемых объектов. В пробоподготовке лекарственных препаратов и внутренних органов человека (печень, стенка желудка) использован метод тонкослойной хроматографии. В пробоподготовке мочи человека использована процедура экстракции. Приводятся характеристики методик определения кодеина. Методики определения кодеина в лекарственных препаратах (40–1200 мг/дм3), во внутренних органах человека (0,01–0,75 мг/г) по его собственной люминесценции с предварительным ТСХ-разделением компонентов, элюированием зоны кодеина в раствор и последующим измерением интенсивности свечения. Методика определения (50–1200 мг/дм3) кодеина в лекарственных препаратах с предварительным ТСХ-разделением компонентов, получением ионного ассоциата кодеина с реактивом Драгендорфа и последующим измерением его коэффициента диффузного отражения. Методика определения (30–320 мкг/дм3) кодеина в моче человека с предварительной экстракцией и последующим измерением интенсивности флуоресценции экстракта ионного ассоциата кодеина с эозином.
кодеин
определение
люминесценция
спектрометрия диффузного отражения
1. Машковский М.Д. Лекарственные средства. М.: Новая волна, 2014. 1216 с.
2. 20th WHO model list of essential medicines. World Health Organization, 2017. 58 p.
3. Приказ Министерства здравоохранения и социального развития РФ от 17 мая 2012 г. № 562н «Об утверждении Порядка отпуска физическим лицам лекарственных препаратов для медицинского применения, содержащих кроме малых количеств наркотических средств, психотропных веществ и их прекурсоров другие фармакологические активные вещества» [Электронный ресурс]. URL: http://base.garant.ru/70184474 (дата обращения 27.10.2019).
4. Постановление Правительства РФ от 30 июня 1998 г. № 681 «Об утверждении перечня наркотических средств, психотропных веществ и их прекурсоров, подлежащих контролю в Российской Федерации» (с изменениями и дополнениями) [Электронный ресурс]. URL: http://base.garant.ru/77663526 (дата обращения 27.10.2019).
5. Moffat A.C., Osselton M.D., Widdop B. Clarke’s analysis of drugs and poisons in pharmaceuticals, body fluids and postmortem material. London: Pharmaceutical Press, 2011. 2473 p.
6. Vitha M.F. Chromatography: principles and instrumentation. Hoboken: Wiley, 2017. 280 p.
7. Беккер Ю. Спектроскопия. М.: Техносфера, 2009. 528 с.
8. Крамаренко В.Ф. Токсикологическая химия. Киев: Вища школа, 1989. 447 с.
9. Немихин В.В., Качин С.В., Шахворостова Т.С. Изучение спектролюминесцентных свойств кодеина с целью его определения в некоторых лекарственных препаратах // Журнал Сибирского федерального университета. Химия. 2012. Т. 5. № 3. С. 289–295.
10. Метелица С.И., Киреева Е.В., Немихин В.В., Качин  С.В., Лосев В.Н., Сагалаков С.А. Экстракционно-флуориметрическое определение кодеина в моче человека // Аналитика и контроль. 2017. Т. 21. № 4. С. 315–321. DOI: 10.15826/analitika.2017.21.4.006.
11. Немихин В.В., Качин С.В., Метелица С.И., Лосев В.Н., Сагалаков С.А., Шахворостова Т.С. Определение кодеина в лекарственных препаратах методом спектроскопии диффузного отражения // Заводская лаборатория. Диагностика материалов. 2016. Т. 82. № 2. С. 20–23.
12. Бушуев Е.С., Бабаханян Р.В., Куклин В.В. Современные проблемы химико-токсикологического анализа наркотических средств и психотропных веществ. СПб.: НИИХ СПбГУ, 2003. 127 с.
13. Приказ Министерства здравоохранения и социального развития РФ от 12 мая 2010 г. № 346н «Об утверждении Порядка организации и производства судебно-медицинских экспертиз в государственных судебно-экспертных учреждениях Российской Федерации» [Электронный ресурс]. URL: http://garant.ru/products/ipo/prime/doc/12077987 (дата обращения: 27.10.2019).
14. Раменская Г.В., Родионова Г.М., Кузнецова Н.И., Петухов А.Е. ТСХ-скрининг токсикологически значимых соединений, изолируемых экстракцией и сорбцией. М.: ГЕОТАР-Медиа, 2010. 240 с.
15. Мелентьев А.Б. Практическое руководство по скринингу лекарственных, наркотических веществ и их метаболитов методом газовой хроматографии с масс-селективным детектором для целей судебной токсикологии. Челябинск, 2001. Ч. 1. 62 с.
16. Немихин В.В., Качин С.В., Сагалаков С.А., Шахворостова Т.С. Люминесцентное определение кодеина в органах человека // Фундаментальные исследования. 2013. № 1. С. 483–486.
17. Государственный реестр лекарственных средств (по состоянию на 2 октября 2019 года) [Электронный ресурс]. URL: document/cons_doc_LAW_119873/ (дата обращения 27.10.2019).
18. European Pharmacopoeia. 8th edition. Strasburg: European Directorate for the Quality of Medicines & Health Care, 2013. 3655 p.
19. Maslarska V., Tencheva J. Simultaneous determination and validation of paracetamol and codeine phosphate in pharmaceutical preparation by RP-HPLC. Int. J. Pharmacy and Pharmaceutical Sci. 2013. vol. 5. no. 2. P. 417–419.
20. Барсегян С.С., Пурвина Е.А., Саломатин Е.М., Свиридова Т.А., Федорова Т.Н. Определение морфина и кодеина при судебно-химических исследованиях с применением одноквадрупольного масс-селективного детектора, сопряженного с ВЭЖХ-системой // Судебно-медицинская экспертиза. 2012. № 6. С. 33–37.

Кодеин – 3-метилморфин, алкалоид опия (рисунок), обладает умеренной анальгетической активностью, в связи с чем препараты на его основе используются при лечении болевого синдрома в сочетании с ненаркотическими анальгетиками, а также для успокоения кашля [1, 2].

nemih1.wmf

Структурная формула кодеина

Однако при длительном использовании кодеин может вызывать физическую зависимость, поэтому отпуск соответствующих кодеинсодержащих препаратов в аптечной сети и контроль их качества регламентируются [3, 4].

В основном кодеин определяют при проверке подлинности лекарственных препаратов, дифференцировании приема лекарственного средства кодеина от немедицинского употребления опиатов, а также в процессе соответствующих судебно-химических исследований при подозрении отравления препаратами опийной группы. С этой целью, как правило, используются хроматографические методы с различными типами детекторов [5]. К их недостаткам следует отнести применение сложного, дорогостоящего оборудования и в ряде случаев необходимость получения дериватов кодеина при его определении в биологических объектах [6].

Методы молекулярной спектрометрии, в частности люминесценции и спектрометрии диффузного отражения, характеризующиеся относительно высокой чувствительностью, экспрессностью и простотой аппаратурного оформления, существенно расширяют возможности определения кодеина в различных объектах [7]. Однако до настоящего времени они практически не использовались в связи с отсутствием соответствующих исследований.

Цель исследования: сравнительный научный обзор работ с результатами исследований спектроскопических свойств кодеина в жидкой и твердой фазах, способов пробоподготовки, а также методиками его определения в лекарственных препаратах и биологических объектах методами люминесценции и спектрометрии диффузного отражения.

Результаты исследования и их обсуждение

Люминесценция кодеина в водных растворах. Молекула кодеина содержит гетероатом азота с неподеленной парой электронов (рисунок). В спектре поглощения присутствует полоса n → π* электронного перехода с λмакс = 285 нм и ε порядка n•102 [8]. Соединения с подобными электронными структурами слабо или вовсе не флуоресцируют [7]. Активация флуоресценции в ряде случаев достигается протонизацией атома азота. В результате становятся возможными π → π* электронные переходы, обуславливающие люминесценцию (флуоресценцию) растворов. В соответствии с молекулярной структурой кодеин является весьма сильным третичным основанием, содержащим =NCH3 группу с рКа = 8,2 [5]. Таким образом, в нейтральных и кислых водных растворах в результате протонизации атома азота формой нахождения кодеина является положительно заряженный ион. В работе [9] для активации свечения кодеина использован 0,05 М раствор H2SO4 при λвозб и λлюм 300 и 345 нм соответственно. Относительный квантовый выход люминесценции кодеина (φкв) составил 0,01. В данных условиях по собственной люминесценции возможно определение микрограммовых содержаний кодеина с пределом обнаружения 3 мг/дм3.

Для повышения чувствительности люминесцентных измерений кодеина использована способность его положительно заряженного иона образовывать ионные ассоциаты с отрицательно заряженными противоионами с высокими квантовыми выходами свечения. В [10] в качестве противоиона использован эозин (φкв = 0,23) – галогенопроизводное флуоресцеина. В диапазоне рН 6–9 эозин находится в виде двукратно ионизированного аниона и образует флуоресцирующий ионный ассоциат с положительно заряженным ионом кодеина, который экстрагируется рядом органических растворителей. Максимальная интенсивность свечения достигается при экстракции ионного ассоциата кодеина с эозином толуолом (λвозб = 520 нм; λлюм = 550 нм). По флуоресценции экстракта возможно определение нанограммовых содержаний кодеина с пределом обнаружения 0,4 мкг/дм3. Аналогичные экстракционно-фотометрические измерения с использованием ионных ассоциатов кодеина с рядом красителей также обеспечивают определения его содержания на уровне n мг/дм3 [8].

Твердофазная спектрометрия кодеина. Тонкослойная хроматография (ТСХ) – один из скрининговых методов идентификации и последующего определения кодеина [5]. После ТСХ-разделения сопутствующих компонентов хроматографическую зону кодеина проявляют различными окрашивающими реагентами, в частности реактивом Драгендорфа (тетрайодовисмутат калия K[BiI4]) [8]. При этом образуется поверхностный ионный ассоциат кодеина с реактивом Драгендорфа с характерной для него оранжевой окраской. В работе [11] получен спектр диффузного отражения ионного ассоциата кодеина с реактивом Драгендорфа в координатах функции Гуревича – Кубелки – Мунка F(R) = [(1 – R)2/2R] – длина волны (нм). Найдены условия определения кодеина на поверхности ТСХ-пластинки путем измерения коэффициента диффузного отражения (R) образующегося ионного ассоциата при λ = 520 нм с пределом обнаружения 9 мг/дм3.

Пробоподготовка объектов исследования. В соответствии со спецификой методов люминесценции и спектрометрии диффузного отражения оптимальными являются способы пробоподготовки, адаптированные к стадии измерения аналитического сигнала.

Кодеинсодержащие лекарственные препараты представляют собой, как правило, многокомпонентные смеси веществ с различными физико-химическими свойствами. Так, кроме кодеина основными компонентами препаратов выступают парацетамол, пропифеназон, метамизол натрия, кофеин, напроксен, фенобарбитал и др. В способе пробоподготовки [12] применительно к веществам опийной группы на первой стадии экстракцией разделяют соединения кислотного и основного характера. Полученные «щелочные экстракты», содержащие кодеин, парацетамол, пропифеназон, кофеин и продукты разложения анальгина, на второй стадии подвергают ТСХ-процедуре. При этом значения Rf составляют для кодеина (0,23), парацетамола (0,71), анальгина (0,65), кофеина (0,66), пропифеназона (0,60).

Согласно действующему нормативному акту [13] в летальном случае при подозрении на отравление человека ядовитым веществом для судебно-химического исследования необходимо направлять печень и стенку желудка. Известно [8], что большинство действующих компонентов лекарств, в том числе кодеин образуют в органах человека комплексы с белками, прежде всего с альбумином. Таким образом, выделение кодеина из органов человека предполагает разрушение этих комплексов. Для этой цели чаще всего используется метод А.А. Васильевой [14], основанный на выделении кодеина из его комплексов с белками подкисленной водой. Основным мешающим компонентом при определении кодеина в данном случае является морфин. Его влияние устраняют специально подобранной хроматографической системой растворителей (ацетон: хлороформ: 25 %-ный раствор аммиака при объемном соотношении компонентов 24: 12: 1). При этом значения Rf кодеина и морфина при последующем ТСХ-разделении составляют 0,23 и 0,09 соответственно.

В большинстве методик скрининга наркотических и лекарственных веществ в биологических жидкостях человека в качестве объекта исследования используется моча. Кроме того, что имеются достаточные объемы доступных для исследования проб, в моче многие вещества, выводящиеся почками, могут обнаруживаться более длительное время, чем, например, в крови. Присутствующий в организме человека кодеин образует в моче конъюгаты, поэтому первичный этап пробоподготовки – гидролиз этих соединений. Для последующего выделения кодеина из гидролизатов используют процедуру экстракции [15]. В данном случае морфин также является основным мешающим компонентом. Для разделения морфина и кодеина используется свойство последнего экстрагироваться из слабощелочных водных растворов диэтиловым эфиром [8]. При этом морфин образует морфинат и остается в водной фазе.

Определения кодеина в лекарственных препаратах. В работе [10] описана методика определения кодеина в некоторых кодеинсодержащих препаратах (Пенталгин Н, Пенталгин Плюс, Седальгин Нео) с предварительным ТСХ-разделением сопутствующих компонентов по его собственной люминесценции в растворах при λ = 345 нм. В пробоподготовке исходных образцов использованы рекомендации [12]. Основные метрологические характеристики методики: линейный диапазон определяемых содержаний кодеина – 40–1200 мг/дм3, предел обнаружения – 7 мг/дм3, Sr не превышает 0,06.

Значительный выигрыш в экспрессности измерений достигнут при определении кодеина в лекарственных препаратах методом спектроскопии диффузного отражения [11]. После ТСХ-разделения сопутствующих компонентов получают поверхностный ионный ассоциат кодеина с реактивом Драгендорфа и измеряют его коэффициент диффузного отражения при λ = 520 нм. Градуировочный график зависимости функции ΔF от концентрации кодеина линеен в диапазоне 50–1200 мг/дм3. Рассчитанный предел обнаружения составил 15 мг/дм3, а Sr не более 0,05.

Определения кодеина в органах человека. В работе [16] описана методика определения кодеина в биоматериале человека (печень, стенка желудка) по его собственной люминесценции в растворах. Исходные образцы предоставлены экспертами Отдела судебно-медицинской экспертизы трупов КГБУЗ «Красноярское краевое бюро судебно-медицинской экспертизы» при реальном отравлении кодеинсодержащими препаратами. В качестве независимого метода исследования использован метод высокоэффективной жидкостной хроматографии (ВЭЖХ) с ультрафиолетовым детектором. Методика позволяет определять 10–750 мкг/г кодеина с пределом обнаружения – 3 мкг/г, Sr не превышает 0,07.

Определение кодеина в моче человека. Концентрации кодеина в моче человека, подтверждающие его наличие в случаях немедицинского употребления, составляют порядка n·102 мкг/дм3. Для его определения использовано свойство толуольного экстракта ионного ассоциата кодеина с эозином интенсивно флуоресцировать при λ = 550 нм [10]. Для апробации методики взяты образцы мочи потребителей опиатов. Для оценки правильности полученных результатов привлечен метод газовой хроматографии (ГХ) с масс-селективным детектором. Подтверждено определение 30–320 мкг/дм3 кодеина с пределом обнаружения 6 мкг/дм3 и Sr не более 0,06.

Заключение

Приведен научный обзор работ с результатами исследований спектроскопических свойств кодеина в жидкой и твердой фазах, способов пробоподготовки, а также методик его определения в лекарственных препаратах и биологических объектах методами люминесценции и спектрометрии диффузного отражения.

В Государственном реестре лекарственных средств кодеинсодержащие препараты отечественных и зарубежных производителей занимают весьма внушительное место [17]. Методики определения кодеина в лекарственных препаратах (в основном ВЭЖХ) хорошо отработаны и включены в известные фармакопеи [18]. Концентрационные диапазоны ВЭЖХ-определений кодеина в данных объектах составляют порядка n·101 – n·102 мг/дм3 [19]. Однако зачастую в ВЭЖХ-методиках необходимо применение в качестве подвижных фаз токсичных растворителей: метанола и ацетонитрила. В экстракционно-фотометрических методиках определения n·мг/дм3 кодеина в виде его ионных ассоциатов с рядом красителей для экстракции последних используют хлороформ [8]. В разработанных авторами [9, 11] методиках определения кодеина в лекарственных препаратах по его собственной люминесценции в растворах и диффузному отражению ионного ассоциата с реактивом Драгендорфа в твердой фазе не используются токсичные органические растворители, а селективность определений обеспечивается на стадии пробоподготовки.

При определении кодеина во внутренних органах человека также в основном используются методы ВЭЖХ и ГХ [20]. Содержания кодеина в образцах печени и стенки желудка при подтверждении диагноза отравления составляют порядка n•101 – n•102 мкг/г. Соответствующие ВЭЖХ- и ГХ-методики обеспечивают определения до n•10-1 – n•10-2 мкг/г кодеина. Люминесцентная методика определения 10–750 мкг/г кодеина [16] с учетом экономичности и относительной простоты инструментария в данном случае может рассматриваться в качестве дополнительной при определенных условиях.

При определении кодеина в биологических жидкостях человека (кровь, моча) в рамках серийных анализов наиболее эффективным методом является хромато-масс-спектрометрия (ГХ-МС). Достигаемые содержания кодеина составляют n•10 мкг/дм3. Вместе с тем в анализе образцов с низкими содержаниями кодеина на стадии пробоподготовки часто требуются проведение реакций ацилирования или силилирования для получения соответствующих дериватов с применением весьма токсичных реагентов. В этой связи методика [10] также может представлять практический интерес, например, при проведении разовых анализов.

В целом описанные в работах [9–11, 16] методики определения кодеина в биофармобъектах методами люминесценции и спектрометрии диффузного отражения могут быть использованы при решении научных и учебных задач в НИИ, вузах, а после необходимой валидации – в контрольно-аналитических лабораториях соответствующего профиля.


Библиографическая ссылка

Немихин В.В., Качин С.В., Кутяков В.А., Сагалаков С.А. ИССЛЕДОВАНИЯ СПЕКТРОСКОПИЧЕСКИХ СВОЙСТВ КОДЕИНА ДЛЯ ЕГО ОПРЕДЕЛЕНИЯ В ЛЕКАРСТВЕННЫХ ПРЕПАРАТАХ И БИОЛОГИЧЕСКИХ ОБЪЕКТАХ МЕТОДАМИ ЛЮМИНЕСЦЕНЦИИ И СПЕКТРОМЕТРИИ ДИФФУЗНОГО ОТРАЖЕНИЯ // Международный журнал прикладных и фундаментальных исследований. – 2019. – № 11. – С. 126-130;
URL: http://applied-research.ru/ru/article/view?id=12943 (дата обращения: 27.10.2020).

Предлагаем вашему вниманию журналы, издающиеся в издательстве «Академия Естествознания»
(Высокий импакт-фактор РИНЦ, тематика журналов охватывает все научные направления)

«Фундаментальные исследования» список ВАК ИФ РИНЦ = 1.074