Несмотря на частое использование в филогенетических исследованиях ластоногих, основанных на изучении нуклеотидных последовательностей [9] к концу 2014 г. в GenBank находилась информация о четырех нуклеотидных последовательностях генетического локуса цитохрома b мтДНК Pusa (Phoca) caspica. Это наглядно демонстрирует недостаточное внимание к изучению внутривидового полиморфизма с использованием молекулярно-генетических маркеров. Проведение внутрипопуляционного сравнительного анализа нуклеотидных последовательностей генетического локуса цитохрома b мтДНК может восполнить пробел в оценке степени полиморфности популяции каспийского тюленя.

В соответствие с этим нами была поставлена цель: установить наличие внутривидового полиморфизма каспийских тюленей с использованием молекулярно-генетических и морфологических маркеров, и сопоставить полученные результаты с условиями обитания вида. На основании прямого секвенирования локуса гена цитохрома b мтДНК нами было проведено исследование для определения степени генетического разнообразия популяции P. caspica.

Материалы и методы

Экстракцию ДНК проводили из образцов покровных тканей падших особей, найденных на побережье северо-западной и западной части Каспия. Всего были рассмотрены образцы от 10 особей собранных нами и одна референтная последовательность из GenBank. ДНК экстрагировалась из тканей с использованием стандартной процедуры лизиса гомогенатов тканей в 50 мМ растворе Трис-HCl буфера, pH=8.0, содержащем 10 mM EDTA, 100 мМ NaCl, 1% SDS, 50 мМ дитиотрейтол и протеиназу K (0.5 мкг/мл) в течение 2-4 часов при 37° ДНК экстрагировали стандартным методом фенол-хлороформной экстракции. Затем образцы ДНК преципитировали в этаноле.

Генотипирование образцов проводили с использованием стандартного набора праймеров L14841 [5’-AAA AAG CTT CCA TCC AAC ATC TCA GCA TGA TGA AA - 3’] и H15149 [5’-AAA CTG CAG CCC CTC AGA ATG ATA TTT GTC CTC A-3’] к генетическому локусу цитохрома b мтДНК [8]. Амплификацию ДНК-локусов осуществляли на термоциклере Bio-Rad С1000 Touch (38 циклов).

Первичный анализ и элайнмент нуклеотидных последовательностей проводили с использованием программы BioEdit Sequence Alignment Editor версии 7.0.5.3 [6]. Выраженность отличий первичных нуклеотидных последовательностей исследованного генетического локуса определялись с использованием параметрической модели Kimura-2 [7] и графически представлялись в виде ME-кладограммы.

Результаты исследования и их обсуждение

Известные молекулярно-генетические исследования каспийского тюленя констатируют, что популяция имеет относительно низкий уровень генетического полиморфизма в пределах традиционных локусов молекулярно-генетических исследований. По сути, основная идея исследований генетического разнообразия вида была направлена на определение места, времени и степени расхождения его от близкородственных видов ластоногих, а не на его внутривидовую структуру. Рассмотрение классических морфометрических параметров А.А. Аристовым и Г.Ф. Барышниковым [1] достаточных предпосылок для выделения внутри вида субпопуляционных структур не дали.

На основании прямого секвенирования локуса гена цитохрома b мтДНК нами было проведено установление степени генетического разнообразия популяции P. caspica.

Анализ полученных нуклеотидных последовательностей локуса cyt b мтДНК показал относительно высокую степень внутривидового полиморфизма P. caspica. Из 11 митотипов, проанализированных нами, 8 оказались уникальными.

Высокополиморфные сайты приводятся ниже:

1. 14663 A→G транзиция

2. 14686 T→A трансверсия

3. 14730 T→C транзиция

4. 14792 G→A транзиция

5. 14801 C→T транзиция

6. 14852 A→G транзиция

7. 14921 C→A трансверсия

8. 14933 C→T транзиция

Таким образом, среди рассмотренных образцов были отмечены следующие точечные мутации: в 75% случаев - это транзиции (мутация замены оснований, когда одно пуриновое основание замещается на другое (аденин на гуанин или наоборот), либо пиримидиновое основание на другое (тимин на цитозин или наоборот), а в 25% случаев – это трансверсии (мутация замены оснований, когда одно пуриновое основание замещается на пиримидиновое или наоборот). Делеций (хромосомные перестройки, при которых происходит потеря участка хромосомы) и инсерций (хромосомные перестройки, при которых происходит вставка участка хромосомы) в пределах изученной выборки обнаружено не было.

Митотипы (генетического локуса cytb мтДНК) исследованных образцов демонстрируют наличие среди них двух повторяющихся (Табл. 1).