Лимфатическая система является важнейшей компонентой основы состояния здоровья человека, обеспечивая постоянство двух основных его составляющих – тканевого и водного гомеостаза. В организме внеклеточный матрикс, интерстициальная жидкость, прелимфатические и лимфатические капилляры, лимфатические сосуды и лимфоузлы с лимфоидным клеточным содержимым представляют собой единые структуры, обеспечивающие движение жидкой и клеточной массы, направленной на выполнение единой задачи – поддержание постоянства внутренней среды организма [1]. Водный гомеостаз является условием жизнедеятельности любого организма. Поддержание водного гомеостаза представляется важнейшей функцией лимфатической системы [2]. Лимфатический дренаж сочетается с нейтрализацией тех вредных веществ, которые в большой или в меньшей степени присутствуют в интерстиции, окружающем клетку. Последняя реализуется путем биофизической, биохимической, иммунной обработки тканевой жидкости и лимфы из нее образующейся [3]. В процессе нейтрализации веществ, вредных для жизнедеятельности организма, принимают участие три гомеостатические системы: лимфатическая, лимфоидная (иммунная) и система рыхлой соединительной ткани, образующая интерстиций – внутреннюю среду организма. Такой функциональный синергизм дает основание рассматривать эти системы как дренажно-детоксикационный комплекс, а его стоит рассматривать как некую функциональную систему, обеспечивающую биобезопасность организма [4].

Цель исследования: изучить состояние и состав биологических жидкостей у молодых и зрелых животных.

Материалы и методы исследования

Эксперименты на животных проведены в соответствии с принципами биоэтики, правилами лабораторной практики. Исследование одобрено локальной этической комиссией КНМУ им. Асфендиярова (протокол № 6 (70) от 30.5.2018). Эксперименты выполнены на 64 лабораторных крысах линии Wistar, разного возраста, которые находились в виварии института на стандартном пищевом и водном режиме. Животные были разделены на 2 группы. 1-я группа животных с 20–40-дневные молодые и 2-я группа 10–12 месяцев – зрелые крысы.

Наркотизация животных осуществлялась ингаляционно эфиром через маску, в которую помещалась ватка с эфиром. Препарировали грудной лимфатической проток у диафрагмы, в которую вставляли градуированную микроканюлю и через которую определяли лимфаток и собирали лимфу для исследований. В каудальной части брюшной полости после сбора лимфы препарировали брюшную аорту, в нее вставляли тефлоновый катетер для сбора крови.

В пробах крови и лимфы определяли содержание общего белка, холестерин, триглицериды, общие липиды, мочевину, креатинин и билирубин. Исследовался уровень активности ферментов: аланинаминотрансферазу (АлАТ), аспартатаминотрансферазу (АсАТ), щелочную фосфатазу, амилазу в лимфе и плазме крови, которые определялись по общепринятым методам с помощью автоматического биохимического анализатора СOBOS INTEGRA 400. Клеточный состав крови и лимфы, мочи определялся с помощью гематологического анализатора «SYSMEX KX-219 9». Электролиты в лимфе и плазме крови исследовались с помощью анализатора AVL 9180 (ROCHE DIAGNOSTICS, Австрия, 2012). Определение биохимических показателей мочи проведено с помощью анализатора (High Technology, США, 2013). Определяли число лейкоцитов, лейкоцитарную формулу – в сухих мазках крови и лимфы, окрашенных по методу С.П. Романовского. Для изучения мазков крови и лимфы использовали световой микроскоп Leica – DМ-1000. Определялся объем плазмы крови по гемотакриту. Объем внеклеточной жидкости определялся путем пропускания тока низкой и высокой частоты с последующим измерением импеданса [5], с использованием реографа «Рео-Мицар». Состав интерстициальной жидкостей был изучен после получения ее фитильковым методом [6]. Изучена иммунограмма плазмы крови и лимфы [7]. Определяли субпопуляцию состава лимфоцитов с помощью проточной цитометрии с применением моноклональных антител Сд-3, Сд-4, Сд-8, Сд-16, Сд-19 с определением иммунорегуляторного индекса на проточном цитометре FACS CАLIBUS. Иммуноглобулины с помощью иммуноферментного метода с применением коммерческих Т-систем производство BECTOR BEST. Артериальное давление, ЧСС у животных регистрировалось через датчик хирургического монитора «Dreger».

Результаты опытов обработаны методом вариационной статистики на ЭВМ с использованием t-критерия Стьюдента. Результаты считались достоверными при р < 0,05.

Результаты исследования и их обсуждение

Лимфоток у молодых крыс составлял 2,4 ± 0,3 мкл/мин при весе крыс 44 ± 5 г или 0,05 мкл/мин на 1 г ткани крысы, а у зрелых крыс составлял 7,9 ± 0,5 мкл/мин при весе животных 259 ± 18 г или 0,03 мкл/мин на 1 г ткани. Также мы заметили повышение холестерина и триглицеридов и общих липидов в крови и лимфе у зрелых крыс на (12,5 % и на 9 %) (12 % и 9 %) соответственно. Глюкоза несколько снижалась у зрелых крыс на 26 % в крови и на 7 % в лимфе (табл. 1).

Исследование ионов в плазме крови, лимфе и моче не выявило значительных изменений у зрелых и молодых животных, только в моче ионы Na повысились на 11,3 % у зрелых животных (табл. 3).

При анализе иммунологического состава крови и лимфы обращает на себя внимание так же увеличение количества лейкоцитов на 36 % в крови и на 12 % в лимфе у зрелых животных, увеличение палочкоядерных и сегментноядерных нейрофилов (табл. 4). Получили увеличение количество нейтрофилов в крови (палочкоядерных и сегментноядерных), а лимфоциты снизились в крови у зрелых крыс, в лимфе повысились. Увеличилось количество IgG иммуноглобулинов, как в крови, так и в лимфе. Увеличилось количество Сд-20 В-лимфоцитов, как в крови, так и лимфе (на 45 и 25 %) соответственно (табл. 4). Свертываемость крови у молодых крыс 3,59 ± 0,4 мин, а у зрелых 3,48 ± 0,4 мин. В лимфе у молодых животных свертываемость 3,90 ± 0,5 мин, у зрелых животных 3,68 ± 0,4 мин. Вязкость крови 5,5 ± 0,5 у молодых и у зрелых 5,3 ± 0,4 животных, в лимфе у молодых 4,4 ± 0,5 и зрелых 4,1 ± 0,6. С увеличением возраста наблюдалось некоторое усиление свертываемости и повышение вязкости крови и лимфы. Обьем плазмы по гематокриту у молодых 46,1 ± 3,2 и у зрелых 44,2 ± 4,1 %. ЧСС у молодых животных 496 ± 15, а у зрелых 481 ± 11 сокращений в минуту. Артериальное давление 103 ± 7 у зрелых животных, у молодых животных 94 ± 11 мм. Диурез у молодых животных составлял 0,000019 ± ± 0,000001 мл/мин на 1 г массы тела, а у зрелых животных 0,000015 ± 0,000001 мл/мин на 1 г массы тела. Снижение составляло 26 % у зрелых крыс.

Получена интерстициальная жидкость (внеклеточная) с помощью фитилькового метода. Ее состав у молодых животных (в ммоль/л): Na – 135 ± 5; К – 4 ± 0,2; Са – 1,1 ± 0,1; Mg – 0,6 ± 0,02; Креатин – 0,1; Глюкоза – 4,9 ± 0,2; Мочевина – 4 ± 0,1 ммоль/л; Белок – 0,9 ± 0,1 г/л. У зрелых животных Na – 139; К – 4,3 ± 0,4; Са – 0,9 ± 0,07; Mg-0,5 ± 0,02; Глюкоза – 4,5 ± 0,1; Мочевина – 4,2 ± 0,3 ммоль/л; Белок – 1,1 ± 0,2 г/л. Как видим, колебания были в физиологических пределах.

Высоко гидратированная и свободная от жира ткань обладает меньшим электрическим сопротивлением, чем жировая, костная и эпителиальная. Токи высоких частот проходят через внеклеточную и внутриклеточную среду, делая возможной оценку свободной от жира массы, а более низкочастотные токи распространяются во внеклеточном пространстве. Переменный ток частотой ниже 40 кГц распространяется преимущественно по сосудам и меж- тканевым щелям, огибая при этом клетки, удельное сопротивление которых (за счет высокого омического сопративления мембран) намного выше удельного сопротивления жидких сред, составляющих внутриклеточную жидкость [5]. Для определения обьема интерстициальной жидкости использовали реограф «Рео-Мицар» с его электрическими характеристиками. Частота зондирующего тока его электродов от 30–200 кГц, что позволило нам использовать его низкочастотные токи (30–40 кГц) для исследовательских целей. По изменениям кривых омического сопротивления группы молодых и группы зрелых животных определяли количество интерстициальной жидкости у этих групп животных. (Группа молодых крыс 33 ± 3 %; группа зрелых крыс 29,5 ± 3,3 % массы тела).

Анализируя полученный экспериментальный материал, можно наблюдать следующую картину – мы получили снижение лимфотока (на 40 %), диуреза (на 22 %) обьема плазмы (на 5 %) крови и интерстициальной жидкости (на 10,61 %) у зрелых животных в сравнении с молодыми. Разные авторы называют разные величины оптимального содержания воды в тканях организмов в зависимости от возраста. Большинство ученых сходятся лишь в том, что с возрастом гидратация тканей организма уменьшается и особенно в сравнении с детским возрастом [8, 9]. У молодых животных наблюдается высокая резорбционная способность лимфатической системы. Однако эта особенность не является признаком высокой активности лимфатической системы. Скорее это признак слабого тонуса лимфатических сосудов и узлов, которое могут депонировать большой обьем жидкости в своем русле. Лимфатические сосуды и узлы у млекопитающих в первые недели жизни неспособны с достаточной скоростью транспортировать лимфу в венозное русло. Экзогенные и эндогенные воздействия вызывают расслабление лимфатических сосудов и узлов [10]. Морфо-функциональная картина лимфатических сосудов и узлов на каждом этапе постнатального развития животных находит отражение в сдвигах лимфотока в ответ на нейрогенные воздействия [9]. Мы обноружили поэтапное становление движения лимфы из тканей в венозное русло как показано в наших ранних работах [9] и других авторов [11]. В первые недели после рождения животных на процессы лимфо- образования действуют в оснавном следующие экстравазальные силы (онкотическое, осмотическое, гидростатическое давления) и экстралимфатические факторы (дыхание, пульсация сосудов, сокращение кишечника, сокращение мускулатуры). Результаты морфофизиологических исследований показали формирование иннервации и структурных элементов стенки лимфатических сосудов и узлов [12]. Становление механизмов движения лимфы начинается у крыс в одно-, двух-месячном возрасте, когда ведущее значение в транспорте лимфы приобретает собственная сократительная активность гладкомышечных клеток лимфтических сосудов и узлов [13]. Сократительные ответы и собственная сократительная активность появляются у взрослых животных с формированием в стенке лимфатических сосудов, в корковом слое узлов нервных волокон и гладкой мускулатуры [12, 14]. Обьем внеклеточной воды у новорожденных и молодых млекопитающих постепенно снижается по мере усиления моторной активности гладкомышечных клеток в лимфатических узлах и сосудах и увеличения выделительной функции почек. Наши данные согласуются с этими взглядами, которые мы получили по динамике водных секторов организма, биохимическим и реологическим показателям крови и лимфы. В крови и лимфе несколько увеличилось количество холестерина и триглицеридов, а количество глюкозы снизилось у зрелых животных. Эти изменения были незначительны, так же незначительно изменилась свертываемость, и вязкость крови и лимфы. Иммунная система крови претерпевает синхронные изменения с лимфатической системой [15]. Эти изменения происходили как в крови и лимфе, так и в структуре лимфатических узлов. В наших исследованиях от молодого организма к зрелому показано увеличение лейкоцитов, нейтрофилов, Сд-20В лимфоцитов в крови и лимфе и лимфоцитов в лимфе.

Заключение

Поддержание водного гомеостаза невозможно без участия лимфатической системы, где лимфатические капилляры, сосуды и лимфатические узлы являются эффекторными структурами. Становление механизмов движения лимфы у крыс начинается от момента рождения до одно-двухмесячного возраста, когда к уже существующим от момента рождения интралимфатическим и экстралимфатическим факторам движения лимфы присоединяются сформировавшиеся сосудодвигательная инервация, гладкая мускулатура и появляется собственная сократительная активность гладкомышечных клеток в лимфатических сосудах и узлах, способствующая активному транспорту жидкости из интерстиция в кровеносное русло и далее, что показано в нашем исследовании. Получено снижение лимфотока, диуреза, обьема интерстициальной жидкости у зрелых животных в сравнении с молодыми. Данные по биохимическим, клеточным, ионным, иммунным показателям крови и лимфы, лимфотоку, диурезу, составу и обьему интерстициальной жидкости соответствовали физиологическим изменениям от молодого организма к зрелому.

Работа выполнена при поддержке и в рамках научного проекта AP05133060 МОН РК.