Моделирование взаимодействия с организмом с целью проведения скрининга с использованием молекулярного докинга, и полученных на его основе соотношений «структура – активность» позволяет проводить целенаправленный поиск соединений с выбранным видом фармакологической активности. Использование молекулярного докинга возможно в том случае если известна мишень, с которой взаимодействует исследуемый лиганд. Перед проведением скрининга методом молекулярного докинга важно узнать фермент, воздействие на который приводит к появлению у исследуемого лиганда анализируемой биологической активности.

Антраниловая кислота принимает участие в широком спектре биохимических реакций, используется в качестве одного из ключевых реагентов в полусинтетическом методе получения ряда антибиотиков, как, например, кальцимицина, проявляющего противомикробную активность [1]. Производные антраниловой кислоты относятся к классу биологически активных соединений, обладающих широким спектром фармакологической активности: анальгетической [2], противовоспалительной и противомикробной [3–6].

Проведение моделирования по анальгетической активности является актуальным при проведении целенаправленного поиска веществ с выраженной анальгетической активностью. Сочетание молекулярного докинга с физико-химическими дескрипторами позволяет учитывать в проводимых исследованиях физико-химические свойства веществ, увеличивая качество модели, как, например, модель «структура – противовоспалительная активность» [7].

Цель исследования: исследование связи «структура – анальгетическая активность» с использованием молекулярного докинга по ферментам циклооксигеназа (ЦОГ) 1 и 2 в ряду N-замещенных антраниловых кислот (10 соединений)

R = CH2CH=C(Cl)CH3 (1);

R = CH2CH=CH2 (2);

R = COC6H3(2,4-Cl2) (3);

R = COCONHCH2CH=CH2 (4);

R = COCOOC2H5 (5);

R = CO(2-фурил) (6);

R = CO Ad (7);

R = CH2C6H5 (8);

R = COC6H4(2-OCH3) (9);

R = COCH2C6H5 (10)

Материалы и методы исследования

Структуры всех лигандов были построены и оптимизированы с использованием программы Gaussian 03 полуэмпирическим методом РМ3 с полной оптимизацией геометрии молекул, и затем были конвертированы в 3D-формат (.pdb) с помощью программы ChemBio3D Ultra 12,0.

Определение анальгетической активности (АА) проводили на беспородных белых мышах массой 18–23 г на модели «горячей пластинки». Исследуемые соединения вводили внутрь в дозе 50 мг/кг за 0,5 ч до помещения животных на металлическую пластинку, нагретую до 53,5 °С. Каждое соединение испытывали на пяти животных. Показателем изменения болевой чувствительности служила измеряемая в секундах длительность пребывания животных на горячей пластине до момента облизывания ими задних лапок [8].

Моделирование лиганд – рецепторных взаимодействий осуществляли программой AutoDock 4.0 в составе программного комплекса MGL Tools 1.5.6, с использованием Ламарковского генетического алгоритма, который позволяет воспроизводить строение комплексов более точно. При проведении молекулярного докинга мы использовали трёхмерные модели молекул фермента, информация о которых получена из базы данных RCSB Protein Data Bank ЦОГ 1 (PDB ID code: 3N8X [9]) и 2 (PDB ID code: 1PXX [10]). Изначально, все молекулы воды были удалены из структуры белка. Файлы рецептора и лигандов были конвертированы в формат PDBQT–файла, с добавлением недостающих атомов водорода и частичных атомных зарядов по методу Гастейгера.

В процедуре докинга, с координатами точек (60×60×60) вокруг каждого моделируемого участка, по ферменту ЦОГ 1 при построении Grid–карт за центр были взяты координаты лиганда (x = –19,44, y = –54,38, z = 6,07), а для фермента ЦОГ 2 координаты лиганда (x = 26,25, y = 25,04, z = 14,66). В результате получено 10 Grid–карт по параметрам для исследуемых соединений по ЦОГ 1 и 2. Оценку качества позиционирования характеризовали величиной RMSD, представляющей собой среднеквадратичное отклонение положения лиганда после докинга от его начального положения в белке.

Результаты исследования и их обсуждение

Структуры всех лигандов были построены и оптимизированы с использованием программы Gaussian 03 полуэмпирическим методом РМ3 с полной оптимизацией геометрии молекул. В результате получены квантово-химические дескрипторы: суммарные значения напряженности электрического поля Σ(Е), потенциала Σ(φ) и заряда Σ (|q|) на атомах углерода, кислорода, азота и водорода (табл. 1). Рассчитанные квантово-химические дескрипторы использовали для теоретического расчёта физико-химических дескрипторов исследуемых соединений с помощью зависимостей «структура – свойство»: констант липофильности (log Pрассч) [11], констант кислотности (pKaрассч) и основности (pKврассч) [12] (табл. 1).

Значения констант липофильности лежат в интервале от 0,44 (у соединения 5) до 2,92 (соединение 6). Константы кислотности, характеризующие ионизацию, рассчитанные значения которых находятся в пределах от 5,10 (соединение 3) до 7,89 (для соединения 4). Значения констант основности, в интервале от 11,91 у соединения 5 до 13,42, для соединения 3.

Для 10 соединений из ряда N-замещенных антраниловых кислот была экспериментально определена АА. Установлено, что большинство изучаемых амидов обладает различным уровнем АА от 13,5 до 27 с (табл. 2).

Моделирование лиганд-рецепторных взаимодействий осуществляли программой AutoDock 4.0 в составе программного комплекса MGL Tools 1.5.6, с использованием Ламарковского генетического алгоритма, который позволяет воспроизводить строение комплексов более точно.

В качестве активного сайта фермента ЦОГ 1 был принят участок макромолекулы, содержащий аминокислоты (SER530, TYR385, ARG120, TYR355, ALA527, MET113, LEU531, VAL116, VAL349, ILE523, PHE518, LEU352, PHE381, TRP387, LEU359, ALA527, ILE517, LEU384) [9] и ЦОГ 2 (VAL349, ALA527, TYR355, VAL523, LEU352, TRP387, PHE518, LEU384, TYR385, ARG120, SER530) [10]. Значимыми считали гидрофобные взаимодействия и образование межмолекулярных водородных связей с аминокислотами активного участка ферментов ЦОГ 1 и 2.

Результат проведенного молекулярного докинга по ферментам ЦОГ 1 и 2 представлен в табл. 2 виде скоринговых функций: энергия связывания (Binding energy (BeЦОГ1 и BeЦОГ2)) и межмолекулярная энергия (Intermolecular energy (ImeЦОГ1 и ImeЦОГ2)), характеризующие взаимодействие лиганда с рецептором.

Таблица 1

Квантово-химические дескрипторы N-замещенных антраниловых кислот

Таблица 2

ААэксп. и скоринговые функции по ЦОГ 1 и 2 N-замещенных антраниловых кислот

С целью составления модели «структура – анальгетическая активность» проведен множественный линейный регрессионный анализ с использованием программы Statistica 6, зависимости ААэксп. от констант липофильности (logPрассч), ионизации (pKaрассч и pKврассч) и скоринговых функций по ферментам ЦОГ 1 и 2 (BeЦОГ1, BeЦОГ2, ImeЦОГ1, ImeЦОГ2).

Всего было сгенерировано свыше 23 уравнений регрессии методом пошагового включения параметров с использованием программы Statistica 6, из которых были отобраны четыре уравнения 1–4 (табл. 3).

Таблица 3

Уравнения множественной регрессии зависимости ААэксп. от logPрассч, pKврассч, BeЦОГ1, ImeЦОГ1, BeЦОГ2, ImeЦОГ2.

Таблица 4

log Pрассч, pKaрассч, pKврассч, скоринговые функции по ЦОГ 1 и 2, ААрассч.4, ААэксп. N-замещенных антраниловых кислот (10 соединений)

Установлено, что полученное уравнение 4 имеет наибольшие значения коэффициента корреляции (R), критерия Фишера (F) и минимальное значение среднеквадратичной ошибки (S). Проведена оценка составленных уравнений методом перекрестного контроля с выбором по одному (Leave-one-out Cross-validation, LOO) (Q2LOO), с использованием программы Statographics. Определен коэффициент детерминации предсказаний Q2LOO, показывающий значимость составленных уравнений. К наиболее значимым по рассчитанным критериям R, F, Q2LOO относится модель в виде уравнений 4.

Уравнение 4, апробировано для теоретического расчёта АА на трех примерах соединений 11 – 13 из ряда N-замещенных антраниловых кислот (табл. 4).

R = COC₆H3(3-CH₃) (11);

R = CO C₆H₄ (4-NO₂) (12);

R = COCH₂Cl (13)

Для проверки проведенного прогноза по соединениям 11–13, была экспериментально определена АА (ААэксп.) (табл. 4).

Оценку точности прогнозирования АА по полученному уравнению 2 проводили с использованием среднеквадратичной ошибки прогноза (Sпрогн.).

Заключение

Проведен теоретический расчёт физико-химических дескрипторов исследуемых соединений с использованием зависимостей «структура – свойство». Для 13 соединений из ряда N-замещенных антраниловых кислот была экспериментально определена АА.

Выполнены исследования взаимодействия анализируемых производных с ЦОГ 1 и 2 методом молекулярного докинга, в результате получены скоринговые функции BeЦОГ1, BeЦОГ2, ImeЦОГ1, ImeЦОГ2. Составлена модель «структура – анальгетическая активность». Проведена проверка полученной модели на трех соединениях. Для оценки качества прогноза рассчитано значение Sпрогн., которое равно 2,43. Полученный результат сопоставим со значением S по уравнению 4.

Таким образом, можно сделать вывод, что полученную модель в виде уравнения 4 можно использовать для прогнозирования АА N-замещенных производных антраниловых кислот.