Полисахариды растений, особенно фруктозосодержащие углеводы, вызывают интерес как вещества, обладающие широким спектром фармакологического действия [1–3]. Известны данные о применении растительных полисахаридов в пищевой промышленности при производстве молока и молочных продуктов, сыра, масла и хлебных изделий в связи с выраженной пребиотической активностью. Известно, что растительные полимеры обладают иммуномодулирующей активностью, так как благоприятно действуют на рост бифидо- и лактобактерий [4].

Приоритетным направлением в изучении углеводов является поиск новых фруктозосодержащих полисахаридов, которые обладают физиологической активностью [5].

Топинамбур – весьма распространенное, многолетнее, лекарственное, травянистое растение. В современной народной медицине листья топинамбура рекомендуют при лечении заболеваний суставов, остеохондрозе, полиартрите, благодаря наличию большого количества биологически активных веществ [6]. Работы авторов [7, 8] посвящены качественному и количественному изучению лекарственного растительного сырья топинамбура и перспективности создания на его основе новых фитопрепаратов лечебного и профилактического действия.

Известно, что из сока Н. tuberosus был выделен фруктозан, однако строение и физико-химические свойства глюкофруктанов, содержащихся в этом растении, произрастающем на территории Кыргызстана, еще не изучены.

Цель исследования: выделение водорастворимых полисахаридов и изучение структуры глюкофруктанов Н. tuberosus (сорт Кыргызский белый).

Материалы и методы исследования

Объектом исследования явились воздушно-сухие измельченные клубни и надземные части Н. tuberosus (сорт Кыргызский белый), заготовленного в фазе конца плодоношения и начала отмирания надземной части.

Выделение глюкофруктанов. Предварительную обработку растительного сырья, экстракцию и фракционное осаждение полисахаридов проводили по известной методике [9].

Воздушно-сухой, измельченный растительный материал массой 250 г последовательно промывали от низкомолекулярных соединений такими растворителями, как хлороформ, гексан и этанол (96 % и 82 %). Для получения суммарного препарата водорастворимых полисахаридов (ВРПС) шрот, оставшийся после удаления низкомолекулярных соединений, экстрагировали водой при нагревании 75–80 °С в течение 1 ч при постоянном перемешивании.

Молекулярно-массовые распределения определены методом эксклюзионной жидкостной хроматографии на жидкостном хроматографе. Навеску 0,02 г образцов отдельных фракций глюкофруктанов растворяли в 2 мл воды. Длина и внутренний диаметр хроматографических колонок с сефадексом G-75 составляли 540 и 12 мм. Они были калиброваны пропусканием стандартов декстранов с ММ 40000 (Ve = 16,5 мл), 20000 (Ve = 31,7 мл) и 10000 (Ve = 38,8 мл). Молекулярная масса индивидуальных полисахаридов составляла 12000–20200.

При фракционном осаждении возрастающими количествами этанола, из водного раствора глюкофруктана были получены четыре фракции. Каждая полученная фракция была отделена центрифугированием, затем промывали этанолом и ацетоном. Оптическое вращение образцов полисахаридов измеряли на сахариметре СУ-3. ИК-спектры полисахаридных препаратов снимали в виде таблетки с бромидом калия (КВг) на приборе UR-20 в диапазоне частот 400–4000 см-1.

На газовом хроматографе Цвет-101 с пламенно-ионизационным детектором выполняли газожидкостную хроматографию (ГЖХ) образцов. Колонки длиной 1 м были заполнены хроматоном W-AW-ДMCS с 20 %-ным поли-1,4-бутандиолсукцинимид, изотермический режим при 190 °С, расход газа-носителя (гелий) – 55–60 мл/мин.

БХ (бумажная хроматография) была выполнена на бумаге марки Filtrax FN-11, нисходящим методом в системе растворителей н-бутанол – пиридин – вода 6:4:3, проявитель – кислый анилин-фталат. ТСХ (тонкослойную хроматографию) проводили на силуфоле UV-254(Chemapol). Для обнаружения соединений применяли следующие проявители: 1) кислый анилинфталат; 2) периодат натрия; 3) марганцовокислый калий 1 %; 4) концентрированная серная кислота.

Кислотный гидролиз. Для определения моносахаридного состава проводили полный кислотный гидролиз образцов полисахаридов 0,5 М раствором соляной кислоты при 100 °С на водяной бане в течение 45 мин. Их мономерный состав устанавливали методом БХ в системе растворителей бутанол – пиридин – вода 6:4:3 параллельно с образцами сахаров. На хроматограммах были обнаружены фруктоза и следы глюкозы.

Периодатное окисление. Для периодатного окисления глюкофруктана 0,1 г образцов растворяли в 25 мл воды, добавляли 20 мл 0,1 М раствора периодата натрия. Смесь выдерживали в темноте при комнатной температуре и постоянном перемешивании. Через сутки отбирали пробы на анализ. Расход периодата натрия оставался постоянным и далее не изменялся. Выделившуюся муравьиную кислоту определяли титрованием 0,1 н раствором едкого натрия.

Метилирование. Для выяснения природы межмоносахаридных связей в молекулах глюкофруктана был применен метод метилирования по Хакомори. Методика метилирования и анализ продуктов гидролиза метилированного продукта ТСХ и количественное соотношение метилированных соединений ГЖХ, использовались аналогично описанным в одной из предыдущих работ [10]. Дезацетилирование и превращение метильных групп в метиловые эфиры достигалось в результате двукратной обработки полисахарида метилиодидом и щелочью в диметилсульфоксиде.

Результаты исследования и их обсуждение

Из растительного сырья Н. tuberosus последовательно выделены спирторастворимые олигосахариды (СРС), сесквитерпеновые лактоны (СЛ), водорастворимые полисахариды (ВРПС), пектиновые вещества (ПВ) и гемицеллюлоза (ГЦ).

Водорорастворимые полисахариды выделяли из корней Н. tuberosus, горячей водной экстракцией, предварительно обработанного растворителями сырья. В результате были получены образцы ВРПС с выходом 24,5 % от массы сырья, представляющие собой гигроскопичные порошки белого цвета. Исследование моносахаридного состава ВРПС показало, что в гидролизатах образцов исходного полисахарида присутствуют только глюкоза и фруктоза, что подтверждает их отнесение к глюкофруктанам (ГФ).

Гель-хроматографией на сефадексе G-75 было установлено, что ГФ, выделенные из этого растения, полидисперсные, их средневесовые молекулярные массы (ММ) варьируют в пределах от 12600 до 21200. С целью разделения ГФ на фракции было проведено их дробное осаждение этанолом, при этом были получены пять фракций. Условия экстракции и выход продуктов представлены в табл. 2.

Фракции 3, 4, 5 являются основными, так как составляют большую часть глюкофруктанов. В дальнейшем в работе мы использовали эти три фракции. Молекулярные массы фракций 3, 4, 5, определенные на сефадексе G-75, при сравнении с истинными декстранами с ММ 10000, 15000, 20000, 40000 и 10000, оказались однородными (табл. 2). По данным полного кислотного гидролиза мономерный состав этих фракций представлен фруктозой и глюкозой. Содержание фруктозы, определенное по методу Кольтгофа, находится в пределах 83,0–96,0 %. Полисахариды имели отрицательный угол удельного вращения, [?]22D~39? (с.1,0; H2O), указывающее D-конфигурацию остатков фруктозы и β-гликозидную связь, как и в других глюкофруктанах.

В ИК-спектрах полисахарида присутствовали полосы поглощения при 815, 865 и 940 см-1, что типично для β-2—>1 связи, характерные для глюкофруктанов типа инулина. Это предположение подтверждается данными периодатного окисления и методами метилирования. Легкость кислотного гидролиза и отрицательное значение угла удельного вращения глюкофруктанов позволяют сделать вывод о преобладании β-гликозидной связи между фруктофуранозными остатками.

При периодатном окислении фракций ВРПС расходовались 0,88–0,98 моль NaIO4 на ангидрозвено, выделение муравьиной кислоты составило 0,042–0,043 моль/ангидрозвено (табл. 3). Установлено, что для полного окисления достаточно 120 ч, далее расход периодата натрия не менялся.

Были обнаружены следовые количества 1,3,4-три-О-Ме-D-фруктозы, что характерно для слабого разветвления между фруктофуранозными остатками ГФ, выделенного в период плодоношения. Для глюкофруктанов, выделенных в фазе отмирания надземной части, во фракциях 3, 4 и 5, фруктофуранозные остатки соединены между собой линейно. Соотношение метилированных сахаров, определенное с помощью ГЖХ для фракций 3, 4, 5, соответствует следующим значениям: 1:4:10; 1:4:12 и 1:4:12. Присутствие в метилированных продуктах в 11 и 12,5 частях основного продукта 3,4,6- три-О-Ме-О-фруктозы указывает на β-(2—>1) гликозидную связь между фруктофуранозными остатками [10].

Выводы

Таким образом, по данным физико-химических исследований, глюкофруктаны, выделенные из растительного сырья H. tuberosus сорта Киргизский белый, относятся к глюкофруктанам инулиновой структуры и состоят из D-фруктофуранозных остатков с β-(2—>1) гликозидными связями.

Исходя из изложенных выше данных, можно предположить следующую структуру ГФ фракций 3, 4 и 5:

α-D-G1u-[1 –β–D-Fru/2-]n-β-D-Fru

n для фракции 3 – 80;

n для фракции 4 – 67;

n для фракции 5 – 65.