Проблема регенерации длинных трубчатых костей и взаимодействие их с прилежащими мышцами является актуальной в биологии и медицине. Это обусловлено частым травматизмом конечностей и необходимостью коррекции врожденных укорочений. Знание морфологических особенностей окружающих кость тканей при различных воздействиях, может существенно сократить время лечения пациентов. Исследованиями передней большеберцовой мышцы в экспериментах по дистракционному остеосинтезу голени с темпом 1,0 мм в сутки с различной дробностью методами гистохимии, морфо- и стереометрии, электромиографии, информационного и статистического анализа установлено преимущество высокодробной круглосуточной автодистракции либо автодистракции лишь в дневное время суток [1, 2]. Определены параллели количественных характеристик процессов естественного роста в раннем постнатальном периоде и индуцированных дозированным растяжением процессов при дистракции [3]. Исследованы капилляры эндомизия передней большеберцовой мышцы при дистракции с 4-кратной и 60-кратной дробностью методом ультраструктурно-стереологического анализа с применением математического аппарата теории информации [2]. Установлено, что в условиях 4-кратной дробности для эндотелия капилляров характерны признаки повышенной метаболической активности и интенсификации окислительно-восстановительных процессов, при этом отмечены минимальные значения коэффициента избыточности и абсолютной организации – показатели надежности системы, а также максимальные значения информационной и относительной энтропии. Продемонстрировано преимущество автодистракции, где коэффициент избыточности и абсолютная организация выше в 2,4 раза по сравнению с методом 4-кратной дробности в конце периода удлинения, значения информационной и относительной энтропии минимальны при автодистракции [2]. При удлинении голени по 0,5 мм в день за 2 приема выявлена нейрогенная атрофия волокон II типа в конце периода дистракции, что отражает бездействие мышц в этом периоде и атрофию всех волокон в конце периода фиксации; волокна различных типов группировались в кластеры [4]. Также денервационные изменения были выявлены в большеберцовой мышце при замещении пострезекционного дефекта голени аппаратом Илизарова в комбинации с цементным спейсером, такие как уменьшение диаметра волокон, рост числа дегенерировавших миоцитов (32,5 %), жировая дистрофия [5]. Проанализирована реакция мышц голени на удлинение в различных ритмах, в том числе при автоматической дистракции с высоким темпом, особенности амплитуды М-ответов [6]. При автодистракции по 1,0 мм на 30 день фиксации в большеберцовой и икроножной мышцах была снижена амплитуда М-ответа по сравнению с исходным уровнем на 53,6 % и 62,8 % соответственно. При высокой скорости автодистракции по 3,0 мм отмечались более выраженные реактивные изменения, такие как застойное полнокровие, околососудистые кровоизлияния, мукоидное набухание эндомизия, утолщение листков капсулы в мышечных веретенах, пикноз ядер интрафузальных мышечных волокон. Амплитуда М-ответа передней большеберцовой и икроножной мышц была снижена соответственно на 79,4 % и 77,9 % [6]. При автодистракции с высоким темпом в сочетании с интрамедуллярным армированием большеберцовой кости титановым стержнем с гидроксиапатитным покрытием были созданы благоприятные условия не только для остеогенеза, а также для адаптации и роста прилежащих тканей [7]. Консолидация регенерата происходила на 14 сутки, в ходе эксперимента сохранялась опорная функция конечности, осложнений инфекционного и неврологического характера не отмечали. Объем и длина мышечного брюшка оперированной конечности были увеличены, цвет соответствовал контралатеральной мышце, не наблюдалось необратимых деструктивных изменений, фиброз ткани фактически отсутствовал, сохранялась полигональность профилей миоцитов, отмечались признаки активации ангио- и неомиогистогенеза [7]. Очевидно, что преобладают исследования большеберцовой мышцы, особенности икроножной мышцы, также подвергающейся дистракционной нагрузке, освещены недостаточно, что послужило поводом для настоящего исследования.

Цель исследования: гисто- и стереометрический анализ икроножной мышцы взрослых беспородных собак в различных условиях дозированного удлинения голени.

Материалы и методы исследования

Исследованы икроножные мышцы взрослых беспородных собак (n = 32) в различных условиях дистракционного остеосинтеза (экспериментатор д.м.н. С.А. Ерофеев). Для сравнительного анализа использованы две экспериментальные группы: I – дистракция в режиме 1,0 мм в сутки за 4 приема (n = 16), II – 1,0 мм методом круглосуточной 60-кратной автодистракции по 0,017 мм (n = 16); также исследованы интактные животные (n = 3). Животных выводили из опыта передозировкой тиопентала натрия через 14 и 28 суток дистракции, на 30 сутки фиксации и через 180 суток после снятия аппарата. Опыты проводились в соответствии с требованиями «Европейской конвенции по защите позвоночных животных, используемых для экспериментальных и других научных целей» (2003–2004 гг.) и были одобрены этическим комитетом ФГБУ «НМИЦ ТО им. акад. Г.А. Илизарова». Фрагменты икроножной мышцы помещали в жидкий азот, изготавливали поперечные криостатные срезы, выявляли активность миозиновой АТФ-азы (рН 9,0) по Padycula, Herman; препараты использовали для стереометрии. Определяли: объемную плотность (мм3/мм3) мышечных волокон (VVmf), микрососудов (VVmv), эндомизия (VVend); численную плотность (мм-2) мышечных волокон и микрососудов (NAmf; NAmv) [8]. Рассчитывали параметр, оценивающий васкуляризацию мышцы и, косвенно, ее оксигенацию как отношение NAmv/NAmf – индекс васкуляризации, видовая константа. Достоверность различий оценивали на основании непараметрического W-критерия Вилкоксона для независимых выборок, различия считали значимыми при р < 0,05, статистическую обработку осуществляли в программе AtteStat версия 10.8.8, встроенной в Microsoft Excel [9]. Часть мышц полимеризовали в эпоксидных смолах, полутонкие срезы окрашивали по M. Ontell, исследовали с помощью стереомикроскопа «AxioScope.A1» и цифровой камеры «AxioCam» (Carl Zeiss MicroImaging GmbH, Германия).

Результаты исследования и их обсуждение

Для икроножной мышцы интактных животных характерны полигональные профили мышечных волокон, минимальные прослойки эндо- и перимизия (рисунок, а). В условиях 4-кратной дробности на поперечных срезах отмечены более крупные диаметры мышечных волокон по сравнению как с интактной мышцей, так и с мышцей группы II (рисунок, б), для последней характерны наиболее многочисленные мелкие микрососуды и миоциты, сохраняющие полигональность профилей (рисунок, в).

По данным стереологического анализа (таблица) VVmf икроножной мышцы через 14 и 28 суток при 4-кратной дробности достоверно выше, чем при автодистракции, что составляет 101 % и 104 % соответственно (Р < 0,05). Через месяц фиксации параметры не различались существенно, к 6 месяцам VVmf в I группе составила 103 % (Р < 0,05) от значения во II-й. При этом NAmf при автодистракции выше в 2,6 раза, чем при 4-кратной дробности к 14 суткам дистракции и в 1,6 раза выше – к 28 суткам (Р < 0,05). Через месяц фиксации параметр несколько снижался в группе II, но достоверно увеличивался в группе I. Данные факты, вероятно, объясняются гипертрофией предсуществующих мышечных волокон в условиях 4-кратной дробности и новообразованием волокон в условиях автодистракции.

На 180 сутки в I группе NAmf существенно уменьшалась относительно предыдущего срока опыта, а во II – несколько возрастала, что значительно и достоверно было выше по сравнению с параметром в I группе (Р < 0,05). VVmv к 14 суткам автодистракции была существенно выше по сравнению с 4-кратной дробностью, составив 181 % (Р < 0,05). К 28 суткам удлинения и через месяц фиксации достоверных различий не выявлено, через 6 месяцев VVmv в условиях автодистракции была почти в 3 раза выше, чем в I группе, составив 257 % (Р < 0,05). NAmv к 14 суткам в режиме автодистракции составила 258 %, а к 28 суткам – 199 % от значения параметров в I группе. Через месяц фиксации параметр возрастал в 2 раза в I группе относительно предыдущего срока (Р < 0,05), но снижался во II-й. При этом в отдаленном периоде NAmv сохранялась неизменной в условиях автодистракции, в то время как при 4-кратной дробности параметр уменьшался более чем в 3 раза относительно предыдущего срока и становился в 2 раза меньшим, чем при автодистракции (Р < 0,05). NAmv/NAmf в группе II был выше в 1,6 и в 1,2 раза по сравнению с параметрами группы I соответственно на 14 и 28 сутки удлинения. Затем параметр в условиях автодистракции снижался в 1,4 раза к 30 суткам фиксации (аналогично большеберцовой мышце), в условиях 4-кратной дробности возрастал в 1,2 раза. Через 6 месяцев NAmv/NAmf икроножной мышцы в группе I уменьшался относительно предыдущего срока в 1,9 раза, в группе II изменялся недостоверно, составив 119 % от значения параметра в I группе. VVend на 14 сутки дистракции достоверно не различалась в двух группах, на 28 сутки параметр возрастал достоверно в обеих группах и был выше в группе II, составив 160 % от параметра в I группе (Р < 0,05). Через месяц фиксации параметр был несколько выше при автодистракции и через 6 месяцев достоверно выше, чем в I группе (Р < 0,05).

Динамика численной плотности мышечных волокон и микрососудов, выявленная для икроножной мышцы, наблюдалась и для передней большеберцовой мышцы [1], где также отмечалась усиленная васкуляризация в периоде удлинения при автодистракции и постдистракционное увеличение численности микрососудов по окончанию периода фиксации в условиях 4-кратной дробности. То есть в условиях автодистракции, приближенной по характеристикам к процессам естественного роста, имеет место ранняя стимуляция процессов новообразования либо раскрытия резервных микрососудов уже в периоде удлинения голени. Дистракционный остеосинтез является ростстимулирующим и формообразующим фактором для всех прилежащих тканей [2, 3]. В мышцах миосателлитоциты переходят в состояние регенерационной активности с увеличением ядерно-цитоплазматического индекса, выходят из ниши базальной мембраны волокон, митотически делятся, дифференцируются в миобласты, которые, сливаясь, формируют миотубы. Признаки дегенеративных изменений, выявленные в большеберцовой мышце при дистракции, как контрактуры мышечных волокон различной степени, картины вакуолизации миоцитов, клеточной инфильтрации, склеротизации интерстициального пространства, жировой дистрофии [1, 3], были характерны и для икроножной мышцы.

Обсуждаются ключевые вопросы, касающиеся продольного роста скелетных мышц во время дистракционного остеогенеза: характер саркомерогенеза при дозированном удлинении; измененная экспрессия саркомерных и несаркомерных генов; гипотеза сателлитных клеток; митогенные факторы; новые подходы к изучению продольного роста скелетных мышц [10]. Анализ генных чипов приводит к парадоксальной точке зрения, показывая, что дистракция вызывает усиление активности гена GADD45, участвующего в остановке роста и разрушении дезоксирибонуклеиновой кислоты [10]. Инсулиноподобный фактор роста (IGF-1) играет важную роль в миогенезе и влияет на развитие мышечной силы или процессы дегенерации, увеличивает пролиферативную активность миосателлитоцитов и миогенную дифференцировку при повреждениях мышц [11]. Саркомерогенез при дистракции определяется эластичным механическим растяжением и возвращает мышцу в оптимальный рабочий режим, предлагается математическая модель, призванная предотвратить перерастяжение мышечной ткани и найти обоснованные решения по оптимальной дробности дистракции и времени удлинения [12]. Во время дистракции применяется ботулинический токсин-А (BtX-A) для уменьшения числа дегенеративно-дистрофических изменений в большеберцовой мышце, а также для уменьшения боли в икроножной мышце и увеличения подвижности суставов [13]. Например, в результате двойного рандомизированного исследования у детей, которым удлиняли нижнюю конечность при коррекции деформаций, доказана безопасность и эффективность BtX-A, как уменьшение болевого синдрома и снижение количества инфекций большеберцовой кости [14]. Исследуются молекулярные механизмы in vitro/in vivo, контролирующие активацию миосателлитоцитов в ответ на потребление аминокислот с разветвленной цепью в поддержке миофибриллярной и митохондриальной адаптации мышц к механическому стрессу (тренировки на выносливость/сопротивление) с целью глубже понять механизмы, управляющие ремоделированием скелетных мышц при различных воздействиях [15].

Заключение

В результате экспериментально-морфологического исследования получена новая информация по миогистогенезу икроножной мышцы в условиях дистракционного остеосинтеза голени в темпе 1,0 мм в сутки в условиях 4-кратной дробности и высокодробной круглосуточной автодистракции. Выявлена однонаправленность адаптационно-приспособительных реакций двух исследованных мышц в различных условиях дистракционного остеосинтеза, свидетельствующих о преимуществе круглосуточной автодистракции.