Одним из ведущих направлений в изучении мутагенной активности пестицидов является генетико-гигиенические исследования. Важной составной частью этих исследований является первичный цитогенетический скрининг, позволяющий уже на начальных этапах работы выявить пестициды – мутагены, оценить их степень потенциальной генетической опасности и дать необходимые рекомендации их использования.

Известно, что применяемые в сельском хозяйстве дозы ряда пестицидов действуют подобно мутагенам, вызывая цитотоксический и отрицательный генетический эффект [2].

Для определения мутагенного и канцерогенного потенциала химических соединений в настоящее время существуют более 120 биологических тестов.

Сравнительно с тестами на животных и микроорганизмах, растительные тест-системы отличаются наибольшей чувствительностью к пестицидам-мутагенам, реагируя на их присутствие как в соматических, так и в генеративных клетках.

Актуальность использования растительных тест-систем обусловлена тем, что культурные и дикорастущие растения в первую очередь подвергаются воздействию химических загрязнителей, пестицидов, УФ и ионизирующего облучения.

Использование растительных объектов имеет следующие преимущества, которые делают их незаменимыми: растения, как и млекопитающие – эукариоты, а потому их реакция на мутагенное воздействие сходны, благодаря тотипотентности растительной клетки через регенерацию некоторые виды растений имеют короткий жизненный цикл и поэтому могут служить удобной генетической моделью, техника эксперимента которой отличается малыми сроками, простотой и дешевизной.

Цель исследования: изучение мутагенных и цитогенетических эффектов триазиновых гербицидов.

Материалы и методы исследования

В экспериментах были использованы воздушно-сухие семена ячменя (Hordeum vulgare L.), сорта «Черниговский-5». Широкое использование семян ячменя для цитогенетических исследований объясняется прежде всего малым числом хромосом – всего 7 пар (2n=14). Хромосомы культурных ячменей довольно крупные, длина от 6 до 8 микрон. Две пары хромосом имеют по одному спутнику. Триазиновые гербициды атразин, пропазин и симазин использовали в виде водных растворов в концентрации 1мг/мл. Обработка семян ячменя растворами гербицидов продолжалась 6 часов. Контрольные семена одновременно погружали на этот же срок в дистиллированную воду. После обработки семена промывали проточной водопроводной водой в течение 30 минут, затем слегка подсушивали и проращивали в чашках Петри на фильтровальной бумаге, смоченной дистиллированной водой при t= 25± 1oC в условиях термостата. За 3-4 часа до первой фиксации семена переносили в насыщенный водный раствор монобромнафталина.

Во всех варрантах проводили 3-4 фиксации с интервалом в 4 часа. Для фиксации брали только главные корешки, достигшие длины 7-8 мм длины. Экспериментальный материал фиксировали в смеси абсолютного спирта и ледяной уксусной кислоты (1:1).Через сутки фиксатор заменяли 70 % спиртом. Окрашивание проводили водным раствором фуксинсернистой кислотой. После мацерации цитазой готовили давленные препараты. В каждом варианте опыта просматривали не менее 300 метафаз, в каждом корешке учитывали не более 50 клеток. Структурные мутации хромосом анализировали посредством метафазного метода в первом митозе меристематических клеток главных корешков на тотальных препаратах окрашенных водным раствором фуксинсернистой кислоты.

При анализе структурных мутаций хромосом учитывали не только общее количество нарушений, вызванных применяемыми в опыте соединениями, но также учитывали все типы хромосомных и хроматидных перестроек, изолокусные разрывы и образование микрофрагментов.

Во всех случаях контролем служил естественный мутационный процесс, происходящий в семенах, не подвергшихся воздействию пестицидов.

Результаты исследования и их обсуждение

Обработка семян ячменя триазиновыми гербицидами индуцировала аберрации хромосом с частотой, достоверно превышающей естественный уровень мутирования.

Сравнительный анализ общей частоты метафаз со структурными нарушениями хромосом, индуцированными триазиновыми гербицидами, показал, что из трех изучаемых препаратов наибольшей мутагенной активностью обладает пропазин (14,47 % ±1,61 %), наименьшей – атразин (10,58 %±1,29 %).

Анализ спектра аберрации хромосом показал, что изучаемые триазиновые гербициды индуцируют все типы нарушений: хромосомные, хроматидные, изолокусные разрывы и микрофрагменты (таблица).

В результате обработки семян ячменя триазиновыми гербицидами во всех вариантах опыта появлялись хромосомные перестройки, которые отсутствовали в контрольном варианте. Пропазин индуцировал структурные нарушения хромосом с частотой 1,05 %±0,47 %, которые были представлены дицентриками и центрическим кольцом. Статистически значимое увеличение выхода аберрантных клеток происходило главным образом за счет хроматидного типа, составивших 4,40±0,94 на 100 метафаз, в контроле этот показатель был равен 0,94±0,34 и изолокусных разрывов в опытном варианте 7,13±1,18, а в контроле 0,98±0,49.

В случае атразина из 60 индуцированных структурных нарушений лишь 1 была зафиксирована как хромосомного типа, что составило 0,18±0,17 на 100 метафаз. Доля нарушений хроматидного типа и изолокусных разрывов примерно была равной. С наибольшей частотой, равной 4,05±0,83 на 100 метафаз, появлялись микрофрагменты.

Обработка семян ячменя раствором симазина также индуцировала все типы аберрации хромосом. Увеличение уровня аберрантных клеток происходило главным образом за счет изолокусных разрывов и хроматидных концевых делеций, которые соответственно составили 6,30±1,13 и 3,25±0,83 на 100 метафаз [1].

Спектр структурных нарушений хромосом индуцированных в семенах ячменя триазиновыми гербицидами

Анализ полученных результатов свидетельствуют о достаточно высокой степени мутагенности триазиновых гербицидов пропазина, атразина и симазина. Все три препарата индуцировали структурные нарушения хромосом с частотой, статистически значимо превышающей естественный уровень мутабильности.

Анализ спектра аберрации хромосом при изучении спонтанного мутационного процесса в клетках корешков ячменя показал, что возникают преимущественно изолокусные разрывы, микрофрагменты и хроматидные изменения при полном отсутствии нарушений хромосомного типа.

При обработке семян ячменя триазиновыми гербицидами индуцировались все типы структурных перестроек хромосом.

Пропазин в использованной концентрации увеличивал выход аберрантных клеток главным образом за счет изолокусных разрывов и хроматидных изменений. Кроме того, в данном варианте опыта появляются нарушения хромосомного типа, отсутствующие в контрольном варианте.

При использовании атразина наблюдалась аналогичная картина. Увеличение общей частоты хромосомных аберрации происходило за счет увеличения в равной степени выхода структурных перестроек хроматидного типа, изолокусных разрывов и микрофрагментов. Наблюдались единичные случаи возникновения нарушений хромосомного типа.

Симазин повысил общую частоту мутирования по сравнению с контролем, главным образом, за счет повышения частоты изолокусных разрывов и нарушений хроматидного типа. Также как и в случае с пропазином и атразином с наименьшей частотой появлялись структурные аберрации хромосомного типа.

Таким образом, данные цитогенетических исследований, в которых обработка воздушно-сухих семян ячменя триазиновыми гербицидами индуцировала высокую частоту хромосомных нарушений, достоверно превышающую спонтанный уровень мутирования, подтверждают результаты экспериментов полученных нами ранее в тестах микроорганизмы/растения.

Выводы. По результатам проведенных исследовании были сделаны следующие выводы:

Триазиновые гербициды пропазин, атразин и симазин в концентрации 1 мг/мл индуцировали в клетках корневой зародышевой меристемы ячменя структурные перестройки хромосом с частотой, достоверно превышающей спонтанный уровень мутирования.

Спектр структурных нарушений хромосом, индуцированных пропазином, атразином и симазином, был представлен всеми типами перестроек.