Неконтролируемое использование гентамицина и неомицина для лечения и профилактики инфекционных заболеваний крупного рогатого скота, птицы и пчёл приводит к их накоплению в мышечных тканях животных, молоке, мёде, яйцах. У людей, потребляющих в пищу такие продукты, возможно возникновение аллергических реакций, появление устойчивых к антибиотикам микроорганизмов, что затрудняет проведение лечения. Регламентированная ВОЗ предельно допустимая концентрация гентамицина в мясе крупного рогатого скота и свиней составляет 100 мкг/кг, в молоке 200 мкг/л, неомицина во всех пищевых продуктах 500 мкг/кг [1 – 3]. В продуктах для детского питания неомицин и гентамицин должны отсутствовать.

Наиболее часто для определения аминогликозидных антибиотиков применяют микробиологические и физико-химические методы, имеющие ряд недостатков и ограничений по продолжительности и чувствительности. Метод поляризационного флуоресцентного иммуноанализа (ПФИА) позволяет выявлять токсиканты непосредственно в пробе без предварительного выделения и характеризуется относительно высокой чувствительностью, поэтому может быть рекомендован для анализа пищевых продуктов. ПФИА уже положительно зарекомендовал себя для определения антибиотиков в медицинской практике [4 – 6], в тоже время методики определения гентамицина и неомицина в пищевых продуктах до настоящего времени не опубликованы.

Цель настоящего исследования – разработка методик определения гентамицина и неомицина в курином мясе, яйцах и молоке методом поляризационного флуоресцентного иммуноанализа.

Материалы и методы исследования

Реактивы: азид, хлорид натрия, сульфат аммония, ацетонитрил, метанол, этанол, хлороформ, ацетон, N-гидроксисукцинимид (о.с.ч., «Sigma-Aldrich», США), триэтиламин, диметилформамид (х.ч. «Merck», Германия); гентамицин (GENT), неомицин (NEO).

Использовали следующие антитела к гентамицину: поликлональные -ПАГ-1 («Abcam», Англия); ПАГ-2 (Китай), ПАГ-3, ПАГ-4, ПАГ-KLH-5 -сконъюгированные с гемоцианином (Королевский колледж, Лондон, Великобритания); моноклональные МАГ (Голландия). Поликлональные антитела к неомицину: ПАН-1 (Китай), ПАН-2 (Королевский колледж, Лондон, Великобритания).

Синтез трейсеров. Для синтеза трейсеров гентамицина в качестве метки использовали – флуоресцеинизотиоционат (ФИТЦ) и 5-([4,6-дихлоротриазин-2-ил]амино)-флуоресцеин (ДТАФ) («Sigma», США). Трейсер неомицина синтезировали с помощью ФИТЦ. В водно-метанольную смесь для связывания только через одну NH₂- группу препарата вводили избыток антибиотика (130 мкмоль). Выделение антибиотиков, меченных флуоресцентной меткой, осуществляли методом тонкослойной хроматографии.

Пробоподготовка мяса и молока. Для извлечения неомицина и гентамицина из куриного мяса и яиц 10 г пробы гомогенизировали, добавляли 100 мл экстрагента и перемешивали в течение 1 ч, (через 20 мин вводили 30 мл 18 %-ого сульфата аммония). Экстракт отделяли фильтрацией и дополнительно очищали от денатурированных белков центрифугированием на настольной центрифуге ЦЛН-2 (КиргизИНТИ, Киргизстан) в течение 8 мин (7000 об/мин). Супернатант использовали для анализа.

Молоко, содержащее менее 2,5 % жира, анализировали после 3-х кратного разбавления боратным буферным раствором. При содержании жира более 2,5 % к 10 мл пробы (молоко, разбавленное в 3 раза) добавляли 5 мл метанола для гидролиза жиров и вводили 2 мл сульфата аммония. Осадок отделяли центрифугированием (3 мин, 7000 об/мин).

Проведение анализа методом ПФИА. К 50 мкл супернатанта добавляли 400 мкл трейсера фиксированной концентрации и 50 мкл антител с концентрацией соответствующей 50 % связыванию. Смесь перемешивали и измеряли поляризацию флуоресценции (двухстадийный формат анализа).

При проведении анализа в одностадийном формате к супернатанту добавляли 450 мкл предварительно синтезированного комплекса антител с трейсером. Для получения комплекса к 500 мл раствора антител с известной концентрацией добавляли 500 мл раствора трейсера. Инкубировали при 25 °С в течение 2 ч и хранили в темном месте при 4 °С.

Результаты исследования и их обсуждение

Поляризационный флуоресцентный иммуноанализ основан на конкуренции определяемого антигена с антигеном, меченным флуоресцентной меткой (трейсер), за ограниченное число центров связывания специфических антител. Аналитическим сигналом в ПФИА служит поляризация флуоресценции, величина которой зависит от концентрации трейсера и антител, строения флуоресцентной метки, присоединяемой к молекуле определяемого соединения, степени очистки трейсера, а также значения констант трейсера (К_Т) и аффинности (К_Аф), указывающих на сродство антител к трейсеру и определяемому соединению [7 – 8].

Выбор концентрации трейсеров осуществляли с учетом величины интенсивности флуоресценции [9]. По максимуму на спектре поглощения при длине волны 492 нм установлены концентрации трейсеров GENT-ФИТЦ; GENT-ДТАФ (250 нг/мл и 40 нг/мл) и NEO-ФИТЦ (180 нг/мл) соответственно. Интенсивность флуоресценции при этом превышает сигнала фона (боратного буферного раствора) в 15 раз.

С помощью графической зависимости mP = f (lg V) с учетом значений mP_max (максимальное значение поляризации флуоресценции для линейного участка графика) и диапазона линейности, определена рабочая концентрация антител (Са_нтител), соответствующая 50 %-ному связыванию в иммунокомплекс. Использование концентраций антител за пределами линейных зависимостей приводит к искажению сигнала из-за неспецифического связывания трейсера с посторонними компонентами сыворотки. Отмечено, что при применении трейсера с флуоресцентной меткой ДТАФ наблюдается более низкое значение mP_max по сравнению с трейсером на основе ФИТЦ. Несмотря на превышение предельного значения mP_max (100 ед) для всех реагентов, кроме ПАГ-KLH-5 и GENT-ДТАФ (mP_max=89), более низкий предел обнаружения и широкий диапазон определяемых содержаний гентамицина достигаются только при применении антител ПАГ-1, ПАГ-3, ПАГ-4 или антител ПАН-1 при детектировании неомицина (табл. 1).

Для оценки сродства и специфичности определяемых соединений и антител по методике Скэтчарда установлены константы аффинности моноклональных антител. Поскольку поликлональные антитела представляют собой смесь высоко и низко аффинных фракций для них рассчитаны средневесовые значения К_Аф [6].

Возможность использования иммунореагентов для поляризационного флуоресцентного иммуноанализа оценивали путем сопоставления констант трейсера и констант аффинности (табл. 2).

Установлено, что во всех случаях константа аффинности превышает константу трейсера на 2 порядка (кроме пары ПАГ-1 и GENT-ДТАФ, для которой это отличие незначительно), что указывает на большее сродство антител к определяемым соединениям, чем к соединениям, связанным флуоресцентной меткой и возможность вытеснения трейсера аналитом из комплекса с антителами. Максимальные значения К_АФ и различие между К_Т и К_Аф наблюдаются при применении трейсеров GENT-ФИТЦ, NEOM-ФИТЦ и антисывороток ПАГ-3, ПАН-1. Эти пары иммунореагентов были использованы для разработки методик определения гентамицина и неомицина.

Оценку специфичности поликлональных антител осуществляли по значениям коэффициентов перекрестного реагирования (ПР %). Как видно из табл. 3 антитела ПАГ-1 и ПАН-1 показывают 100 % связывание с гентамицином и неомицином и небольшие значения ПР % с другими соединениями родственного строения, которые могут присутствовать в пищевых продуктах. Это в первую очередь стрептомицин, входящий в состав комбинированных ветеринарных препаратов наряду с гентамицином (ПР % менее 0,1) и бацитрацин, применяемый как кормовой антибиотик, следовательно, при применении этих антител возможно селективное определение гентамицина и неомицина методом ПФИА.

Изучены условия определения антибиотиков с использованием антител предварительно связанных с трейсером в иммунокомплекс. Сопоставлены метрологические характеристики определения неомицина и гентамицина методом ПФИА с применением комплексов антител с трейсером (одностадийный формат анализа) и свободных (двухстадийный формат анализа) антител (табл. 4). Отмечено, что применение комплексов антител с трейсером не приводит к изменению диапазона определяемых содержаний и снижению предела обнаружения. В тоже время повышается стабильность раствора антител, так при повторном анализе не наблюдается отклонения от градуировочного графика (срок хранения возрастает с 7 до 50 дней), однако продолжительность получения аналитического сигнала увеличивается с 7 до 20 мин).

Для выделения неомицина и гентамицина из куриного мяса и яиц применяли экстракционные системы на основе ацетонитрила, гексана, дихлорэтана, ацетона, метанола и фосфатного буферного раствора (pH 7,2). Сопоставление значений R % антибиотиков показало, что только фосфатный буферный раствор, содержащий сульфат аммония, и ацетонитрил обеспечивают практически полное извлечения лекарственных препаратов из мяса и яиц (R 96 %). Применение в качестве экстрагентов гексана, ацетона, дихлорэтана менее эффективно.

Разработанные методики апробированы при анализе куриного мяса, яиц и молока (табл. 5).

Таблица 1

Выбор рабочей концентрации антител для определения гентамицина и неомицина

Таблица 2

Константы аффинности и константы трейсера

Таблица 3

Коэффициенты перекрестного реагирования (ПР %) поликлональных антител