Лекарственные средства, заключенные в ЛП, позволяют осуществлять их направленную доставку в клетки, в частности в МФ [3, 5, 10]. Такая форма лизосомотропных лекарственных средств актуальна для лечения туберкулеза, так как при этом заболевании возбудитель (M. tuberculosis) паразитирует в вакуолярно-лизосомальном [6, 7, 8] аппарате МФ, где его уничтожение представляет наибольшую проблему. Включение в ЛП определенных размеров противотуберкулезных средств с высокой гепатотоксичностью, к которым относится и основной противотуберкулезный препарат – гидразид изоникотиновой кислоты, снижает риски повреждения печени – гепатоцитов и клеток эндотелия синусоидов печени, которые не способны захватывать корпускулярный материал в определенном размерном диапазоне. «Корпускулярность» лекарственной формы при ее захвате МФ может быть сопряжена с активацией синтеза и секреции МФ различных ферментов, среди которых представляют интерес матриксные протеиназы, как факторы с потенциальной антифибротической активностью [2, 4, 9]. Ранее нами было показана высокая антифибротическая активность декстразида [7], но механизм этого феномена еще не вполне понятен. Вместе с тем, известно, что свойство «корпускулярности» ЛП в сочетании с их способностью «экранировать» заключенные в них макромолекулы с относительно невысокой биодеградабельностью может обусловить развитие в организме стойкой реакции активации системы мононуклеарных фагоцитов, в частности, усилении экспрессии и секреции протеаз [4].
К одним из ключевых ферментов, принимающих участие как в воспалительных, так и в репаративных восстановительных процессах в различных тканях относят металлопротеиназы ММP-1 и MMP-9 со способностью гидролиза молекул внеклеточного матрикса, в частности коллагена.
В этой связи представляется полезным исследовать эффекты ЛП-ДЗ на «внеклеточный» гидролитический потенциал МФ, в частности, ММP-1 и MMP-9, о котором судили по экспрессии металлопротеиназ – MMP-1 и MMP-9, обладающих как продеструктивным (провоспалительным) потенциалом, так и свойством гидролиза структур молекул внеклеточного матрикса, в частности коллагена, при нейтральном РН, что характерно для заключительной (репаративной) фазы воспаления, сопровождающейся синтезом коллагена, приводящего к фиброзированию органов.
Целью настоящего исследования было изучение влияния липосом различных размеров с размещенной в них композиции с декстразидом М.м. 60 кДа, а также «пустых» липосом и «свободного» декстразида в качестве контроля, на экспрессию макрофагами матриксных металлопротеиназ MMP-1 и MMP-9 in vitro.
Материалы и методы исследования
Исследование биологических эффектов «пустых» ЛП и ЛП-ДЗ – ЛП, включающих ДЗ (гидразид изоникотиновой кислоты с окисленным декстраном М.м. 60 кДа [1]), проводили in vitro на МФ, выделенных из перитонеального транссудата мышей-самцов линии BALB/c 2-х месячного возраста, с массой тела 21-22 гр., полученных из питомника ФГБНУ Института клинической иммунологии ФАНО России (г. Новосибирск, Россия). Перитонеальные МФ получали от интактных животных после дислокации их позвонков в шейном отделе под легким эфирным наркозом. Клетки из перитонеального транссудата эксплантировали в культуру и культивировали при температуре 37 °C и 5 %-ном содержании CO2 в пластиковых планшетах в течение 3-х часов на покровных стеклах для прикрепления МФ (106 клеток в 1,5 мл среды 199, содержащей 10 % сыворотки эмбрионов коров). Через 3 часа неадгезированные клетки смывали средой для культивирования. Полученные первичные культуры МФ культивировали в течение 24 часов с целью их адаптации для последующих экспериментальных воздействий.
Для получения липосом, содержащих декстразид (ЛП-ДЗ), 20 мг фосфатидилхолина (Sigma, USA) помещали в 2 мл раствора декстразида с М.м. 40 кДа (в 0,9 % NaCl) в концентрации 10 мг/мл, полученного на основе окисленного декстрана (при содержании гидразида изоникотиновой кислоты – 5 мг/мл), и оставляли набухать при температуре 4-6 °С на 24 часа [1, 10]. Для получения ЛП-ДЗ заданной размерности липидную суспензию многократно продавливали через ацетат-целлюлозные фильтры (Sartorius, Germany) как это было описано ранее [1, 10]. В результате получали фракции ЛП-ДЗ в размерных диапазонах 0,15-0,20 мкм и 0,20-0,45 мкм [1], содержащие декстразид внутри жидкой фазы липосом в концентрации 10 мг/мл. При таком способе получения липосом концентрация «свободного» (вне липосом) декстразида в исходной суспензии была эквивалентна его концентрации в липосомах. На начальном этапе получения «пустых» липосом 20 мг фосфатидилхолина помещали в 2 мл 0,9 % раствора NaCl; далее проводили процедуры по схеме (для получения ЛП-ДЗ), приведенной выше. Исследовали влияние ЛП-ДЗ (в конечном разведении исходной суспензии ЛП-ДЗ в среде для культивирования 1:100) разных размеров (0,15-0,20, 0,20-0,45 мкм) на экспрессию металлопротеиназы-1 (MMP-1) и металлопротеиназы-9 (MMP-9) МФ. Дополнительно исследовали биологические эффекты «пустых» ЛП тех же размеров с эквивалентным содержанием фосфатидилхолина 100 мкг/мл и «свободного» ДЗ в конечном разведении в среде для культивирования 100 мкг/мл. В качестве общего контроля служили «интактные» культуры перитонеальных макрофагов. Оценку влияния ЛП и ЛП-ДЗ на экспрессию MMP-1 и MMP-9 МФ проводили через 24 часа после их внесения в первичные культуры МФ. Внесение ЛП-ДЗ и ЛП в культуры МФ осуществляли путем одноразовой замены изначальной среды культивирования на среду, содержавшую ДЗ, ЛП-ДЗ и ЛП в соответствующей концентрации.
Иммуноцитохимическое исследование экспрессии MMP-1 и MMP-9 проводили непрямым иммуноцитохимическим методом при помощи полимерной системы ImmPRESS Anti-Rabbit Ig Polymer Detection Kit (США) в соответствии с прилагаемой инструкцией производителя. Для исследования экспрессии ферментов МФ, МФ в культурах фиксировали 4 % водным раствором нейтрального формалина, демаскирование исследуемых ферментов проводили тритоном Х-100 (0,3 % раствор в фосфатном буфере, pH = 7,2). Экспрессию MMP-1 и MMP-9 выявляли при помощи антител: anti-MMP-9 (Isotype: Rabbit polyclonal antibody; C.N. ab38898; Abcam, США); anti-MMP-1 (Isotype: Rabbit polyclonal antibody; C. N. PAB12708, Abnova, США). Для визуализации кроличьих первичных антител использовали полимерную систему ImmPRESS Anti-Rabbit Ig (peroxidase) Polymer Detection Kit – Vector Labs MP-7401-15 (США). Окраску препаратов проводили в растворе хромогена диаминобензидина (DAB), содержащем Н2О2.
Учитывали количество МФ, высокоэкспрессирующих MMP-1 и MMP-9 (у которых более половины цитоплазмы было окрашено ДАБ). Количество этих МФ выражали в %. Поскольку экспрессия исследуемых ферментов в той или иной степени выявлялась во всех МФ, то количественный анализ экспрессии MMP-1 и MMP-9 во всех исследуемых популяциях МФ в контрольной и экспериментальной группах проводили при помощи компьютерной морфометрии. Зоны цитоплазмы, содержащие выявляемые ферменты, окрашивались в коричневый цвет. Размеры окрашенных зон цитоплазмы МФ исследовали морфометрически в условных единицах по общей площади (в кв. пикселях) окрашенных зон (на пяти микрофотографиях, в которых размещалось от 50 до 70 МФ) после их фотографирования в микроскопе «AxioVision Z1» (Zeiss, Германия) при увеличении в 400 раз и с помощью морфометрического анализа цифровых откалиброванных изображений при помощи программы «ВидеоТест Морфо 3.2». Далее производили
расчет средней площади окрашенных зон цитоплазмы в пересчете на один МФ – усредненный показатель экспрессии (в условных единицах). Статистическую обработку результатов исследования проводили методами вариационной статистики. Данные представляли в виде средних арифметических величин и их ошибок. Вероятность достоверности различий сравниваемых средних величин определяли с помощью непараметрического критерия Манна-Уитни. Для статистической обработки результатов исследования использовали пакет прикладных программ «Statistica 7.0» (StatSoft. Inc. 2004).
Результаты исследования и их обсуждение
Согласно полученным данным (рис. 1), культивирование МФ в среде, содержащей «пустые» ЛП всех исследуемых размеров, не приводило к увеличению в культурах количества МФ с выраженной экспрессией MMP-1 (рис. 2). Увеличение количества МФ, экспрессирущих MMP-1 возросло при культивировании МФ с ЛП-ДЗ 0,15-0,20 мкм и в среде, содержащей
«свободный» декстразид. При этом, инкубирование МФ с ДЗ приводило к увеличению экспрессии MMP-1 МФ в 2,4 раза. ЛП-ДЗ с размерами 0,15-0,20 и 0,20-0,45 мкм увеличили экспрессию MMP-1 МФ по сравнению с контролем соответственно в 4,2 и 1,7 раза. Стимуляция экспрессии MMP-1 МФ «пустыми» ЛП (повышение экспрессии в 2,1 раза) отмечена только при использовании ЛП меньших размеров (0,15-0,20 мкм).
При изучении влиянии ДЗ, ЛП и ЛП-ДЗ на экспрессию ММР-9 МФ в целом были получены аналогичные закономерности. Культивирование МФ в среде, содержащей «пустые» ЛП всех исследуемых размерностей не приводило к увеличению в культурах количества МФ с выраженной экспрессией MMP-9 (рис. 3). Увеличение количества МФ, экспрессирущих MMP-9 возросло только при культивировании МФ с ДП-ДЗ 0,15-0,20 мкм и в среде, содержащей «свободный» декстразид. Инкубирование МФ с ДЗ приводило к увеличению экспрессии MMP-9 МФ в 2,3 раза. ЛП-ДЗ с размерами 0,15-0,20 и 0,20-0,45 мкм увеличили экспрессию MMP-9 МФ по сравнению с контролем соответственно в 2,9 и 1,9 раза. Стимуляция экспрессии MMP-9 МФ «пустыми» ЛП отмечена только при использовании ЛП меньших размеров (0,15-0,20 мкм).
Таким образом, в нашем исследовании было показано, что фагоцитоз ЛП-ДЗ сопряжен с повышением экспрессии металлопротеиназ MMP-1 и MMP-9. «Пустые» ЛП размером 0,15-0,20 мкм также обладали такой способностью в отношении экспрессии MMP-1 и MMP-9, но в меньшей степени. При этом было выявлено, что определенный «вклад» в стимуляцию ЛП-ДЗ экспрессии ММР-1 и ММР-9МФ вносит ДЗ. Выявленная нами способность МФ, поглотивших ЛП-ДЗ, изменять экспрессию гидролаз, свидетельствуют о том, что ЛП, ДЗ и в большей степени ЛП-ДЗ, поглощенные МФ, способны модулировать их функциональный статус, что, видимо, может изменить развитие типовых процессов, таких как воспаление, репаративная регенерация
или фиброз.
Ранее нами было показано, что количество ЛП-ДЗ, фагоцитированных МФ, возрастает при уменьшении размеров ЛП-ДЗ [8]. Очевидно, что и суммарный объем и количество захваченных ЛП меньших размеров будет большим, чем ЛП-ДЗ более крупного размера. При этом будет захвачено и большее количество ингредиентов, размещенных в ЛП меньшего размера, нежели в более крупных. Следовательно можно ожидать более выраженных биологических эффектов у МФ на большее количество действующих факторов (декстрана и изониазида), но при этом следует принимать во внимание, что время пребывания ДЗ такого размера и количества будет большим (время для гидролиза). Следовательно, индуктивный «импульс» будет пролонгирован, чем, видимо, можно объяснить полученные эффекты [6, 8]. Это тем более вероятно, что декстраны лизосомотропны и медленно биодеградируемы. Время их полувыведения из организма около
3,5 суток [6].
Следует также отметить, что ЛП-ДЗ с размерами 0,15-0,20 мкм в большей степени стимулировали экспрессию MMP-1 и MMP-9 МФ, чем «свободный» декстразид. Напротив, эффект стимуляции экспрессии MMP-1 и MMP-9 МФ ЛП-ДЗ с размерами 0,20-0,45 мкм был слабее, чем ДЗ. Эти данные могут косвенно свидетельствовать о большей стабильности ЛП-ДЗ с размерами 0,20-0,45 мкм (т.е. о более медленном высвобождении ДЗ из комплекса ЛП-ДЗ), фагоцитированных МФ, по сравнению с ЛП-ДЗ с размерами 0,15-0,20 мкм. Кроме того, несмотря на сходные эффекты использованных в эксперименте лизосомотропных факторов, наблюдали определенные различия выраженности ответа на них МФ, при рассмотрении количества МФ, экспрессирующих MMP-1 и MMP-9, и активности проявления их синтеза (рис. 1, 2, 3, 4).
Рис. 1. Результаты исследования in vitro количества макрофагов ( %), экспрессирующих MMP-1, после добавления в среду ЛП, ДЗ и ЛП-ДЗ. Достоверность различий представлена
при сравнении средних величин показателей всех экспериментальных групп с величинами показателей в контроле (К) в виде: * Р < 0,05, * Р < 0,01. Обозначения: ДЗ – «свободный» декстразид, ЛП (0,2) – липосомы с размерами 0,15-0,20 мкм, ЛП (0,4) – липосомы с размерами 0,20-0,45 мкм, ЛП-ДЗ – композиция из ДЗ и липосом
Рис. 2. Результаты исследования in vitro влияния ЛП, ДЗ и ЛП-ДЗ на уровни экспрессии макрофагами MMP-1. Достоверность различий представлена при сравнении средних величин показателей всех экспериментальных групп с величинами показателей в контроле (К) в виде: * Р < 0,05, * Р < 0,01. Обозначения: ДЗ – «свободный» декстразид, ЛП (0,2) – липосомы с размерами 0,15-0,20 мкм, ЛП (0,4) – липосомы с размерами 0,20-0,45 мкм, ЛП-ДЗ – композиция из ДЗ и липосом
Рис. 3. Результаты исследования in vitro количества макрофагов ( %), экспрессирующих MMP-9, после добавления в среду ЛП, ДЗ и ЛП-ДЗ. Достоверность различий представлена при сравнении средних величин показателей всех экспериментальных групп с величинами показателей в контроле (К) в виде: * Р < 0,05, * Р < 0,01. Обозначения: ДЗ – «свободный» декстразид, ЛП (0,2) – липосомы с размерами 0,15-0,20 мкм, ЛП (0,4) – липосомы с размерами 0,20-0,45 мкм, ЛП-ДЗ – композиция из ДЗ и липосом
Рис. 4. Результаты исследования in vitro влияния ЛП, ДЗ и ЛП-ДЗ на уровни экспрессии макрофагами MMP-1. Достоверность различий представлена при сравнении средних величин показателей всех экспериментальных групп с величинами показателей в контроле (К) в виде: * Р < 0,05, * Р < 0,01. Обозначения: ДЗ – «свободный» декстразид, ЛП (0,2) – липосомы с размерами 0,15-0,20 мкм, ЛП (0,4) – липосомы с размерами 0,20-0,45 мкм, ЛП-ДЗ – композиция из ДЗ и липосом
Заключение
Результаты исследования могут быть полезны для понимания эффектов лекарственных средств для лечении заболеваний с гранулематозным типом воспаления, осложненных фиброзом (туберкулез, кандидоз), а также при разработке других перспективных биосовместимых липосомальных «конструкций» с целью их адресной доставки в клетки-мишени, обладающие фагоцитозной активностью и, возможно, для профилактики и лечения фибротических осложнений при ряде патологических процессов.
Исследование выполнено с использованием оборудования ЦКП «Современные оптические системы» на базе ФГБНУ «Научно-исследовательский институт экспериментальной и клинической медицины».