Препараты иммуноглобулинов человека для внутривенного введения (ИГЧВВ) являются неотъемлемой частью схем терапии иммунодефицитных состояний и аутоиммунных заболеваний, используются для профилактики и лечения вирусных и бактериальных инфекций, а также при лечении неврологических, онкологических и гематологических заболеваний. Большинство схем лечения предусматривает неоднократное введение этих препаратов в больших объемах. Наряду с высокой терапевтической эффективностью и низкой аллергенностью, препараты ИГЧВВ обладают способностью к спонтанной активации системы комплемента с образованием анафилатоксинов, активации калликреин-кининовой, плазминовой систем и системы свертывания крови, изменению реологических свойств крови, инициации внутрисосудистого гемолиза [7, 13, 18-20, 26, 28]. Это влияние может быть обусловлено остаточным содержанием в готовом препарате таких компонентов плазмы крови, как анти-D антитела, гемагглютинины, активатор прекалликреина (АП), активированные факторы свертывания крови, связанным с невозможностью на этапах технологического процесса полностью исключить контаминацию готовой формы препарата «нецелевыми» белками плазмы крови. Кроме того в процессе изготовления и/или хранения возможны конформационные изменения молекул иммуноглобулинов. Для минимизации риска развития осложнений к препаратам ИГЧВВ предъявляют высокие требования специфической безопасности, которую характеризуют такие показатели качества, как: «Антикомплементарная активность», «Анти-А и анти-В гемагглютинины», «Анти-D антитела», «Активатор прекалликреина».
В соответствии с фармакопейными требованиями, антикомплементарная активность (АКА) выражается как расход комплемента в испытуемом образце по отношению к контрольному комплементу, принятому за 100 % (норма не более 50 %), что соответствует допустимому пределу АКА – не более 1 СН50 на 1 мг белка иммуноглобулина [2, 12]. Этот уровень АКА позволяет минимизировать риск спонтанной активации комплемента, которая клинически может проявляться одышкой, дрожью, в редких случаях реакциями анафилактоидного типа [7]. Определение антикомплементарной активности ИГЧВВ основано на способности иммуноглобулинов человека связывать комплемент, препятствуя лизису сенсибилизированных эритроцитов барана. Методика впервые утверждена в составе Европейской Фармакопеи (ЕФ) в 1994 г., в настоящее время используется в качестве стандартного унифицированного метода испытаний ИГЧВВ всеми мировыми производителями. В Российской Федерации (РФ) до 2016 г. существовали методики, отличные от признанной в мире. С введением в действие Государственной фармакопеи РФ XIII выпуска (ГФ XIII), в состав которой вошла гармонизированная с ЕФ и оптимизированная методика, изучение антикомплементарной активности ИГЧВВ российскими производителями соответствует мировым стандартам [3, 4]. К спонтанному связыванию комплемента способны агрегированные и/или конформационно измененные в процессе производства или хранения молекулы иммуноглобулинов [26]. В связи с этим препараты ИГЧВВ подлежат испытанию методом высокоэффективной жидкостной хроматографии на содержание полимеров и агрегатов, суммарное количество которых не должно превышать 3 % [2, 12].
В соответствии с международными и российскими требованиями препараты ИГЧВВ получают из объединенной плазмы более 1000 доноров [2, 12, 37], что обуславливает высокую вероятность содержания в них анти-А и анти-В гемагглютининов, а также анти-D антител. Количество гемагглютининов и их принадлежность к иммуноглобулинам классов М (IgM) или G (IgG) зависит от превалирования в производственном пуле плазмы доноров с группой крови I(0), II(А) и/или III(В). Инфузии пациентам (не I группы крови) больших объемов препаратов ИГЧВВ, содержащих гемагглютинины, могут вызвать интраваскулярный гемолиз с резким снижением гемоглобина, гематокрита, ретикулоцитозом, гипербилирубинемией, гемоглобинурией и другими симптомами, вплоть до почечной и полиорганной недостаточности, а также внесосудистые нежелательные эффекты, связанные с активацией макрофагов [6, 8, 9]. Для исключения подобных осложнений в препаратах ИГЧВВ нормируется содержание анти-А и анти-В гемагглютининов. Международные требования устанавливают допустимый предел содержания гемагглютининов, соответствующий разведению ИГЧВВ 1:64, в котором отсутствует агглютинация тестовых эритроцитов. До 2012 г. в ЕФ был регламентирован один метод определения содержания анти-А и анти-В антител – непрямой гемагглютинации. Актуальная версия ЕФ предусматривает использование методов непрямой и прямой гемагглютинации, причем для количественного определения рекомендована реакция прямой гемагглютинации [12]. Следует отметить, что изменение метода контроля препаратов ИГЧВВ не привело к снижению числа случаев гемолитических осложнений иммуноглобулинотерапии, связанных с содержанием гемагглютининов [31]. Более того, применение современных технологий, позволяющих сохранить максимально полный спектр антител в препаратах ИГЧВВ, обуславливает увеличение содержания в них гемагглютининов [30]. Допустимость использования двух методов изучения содержания гемагглютининов при высокой вариабельности результатов не позволяет в полной мере достоверно оценить уровень безопасности применения конкретного препарата ИГЧВВ, в том числе в сравнении с аналогами. В РФ порядок определения анти-А и анти-В гемагглютининов в препаратах ИГЧВВ регламентирует общая фармакопейная статья в составе ГФ XIII, предусматривающая проведение испытаний методом непрямой гемагглютинации «на плоскости» или в геле, нормы содержания соответствуют международным требованиям [2].
До введения международных требований около 6 % коммерческих препаратов ИГЧВВ содержали анти-D антитела в количестве, превышающем 0,0475 МЕ/мл (агглютинация в разведении 1:16 – 1:32) [23, 33]. Инфузии больших объемов таких препаратов приводили к развитию интраваскулярного гемолиза у резус-положительных пациентов [9, 15, 24]. Для исключения подобных осложнений иммуноглобулинотерапии в международную практику производства препаратов ИГЧВВ с 2006 г. введено нормирование содержания анти-D антител: не более титра положительного стандарта в модифицированной реакции Кумбса [12, 23]. Положительный стандарт содержит анти-D антитела в количестве, соответствующем антирезусной активности 0,0475 МЕ/мл (агглютинация в разведении 1:8). Для препаратов ИГЧВВ российского производства до настоящего времени отсутствовали требования по содержанию анти-D антител. Однако с введением в действие ГФ XIII этот пробел в нормировании специфической безопасности отечественных иммуноглобулинов устранен: изучение содержания в них анти-D антител соответствует мировым стандартам [2].
Присутствие в ИГЧВВ АП, являющегося биологически активным фрагментом фактора свертывания крови XII (фактора Хагемана), обуславливает возможность гипотензивного эффекта. АП активирует прекалликреин, переводя его в калликреин, который, в свою очередь, вызывает активацию кининового пути по принципу положительной обратной связи и приводит к вазодилатации и гипотензии [6, 21, 29]. Нормирование содержания АП в препаратах ИГЧВВ в количестве не более 35 МЕ/мл было установлено ЕФ в 1998 г. и является актуальным в настоящее время [12]. Метод определения основан на превращении прекалликреина в калликреин в присутствии АП, а образовавшийся калликреин способен отщеплять хромофор (п-нитроанилина) от синтетического хромогенного субстрата, что позволяет определять скорость протеолиза спектрофотометрическим методом. Российские производители не изучают содержание АП в ИГЧВВ, что не позволяет в полной мере оценить безопасность их применения [5].
Возможность возникновения тромбоэмболических осложнений при внутривенном применении иммуноглобулинов, включая инсульт, инфаркт миокарда, тромбоэмболию легочной артерии и тромбоз глубоких вен/артерий, указана в инструкциях по применению всех ИГЧВВ зарубежных производителей и одного – отечественного [1]. Ранее эти осложнения связывали исключительно с повышением вязкости крови при введении препарата, а возможным способом их исключения являлось соблюдение режима дозирования и скорости инфузии [8]. Инцидент значительного повышения частоты возникновения тромбоэмболических осложнений, произошедший в 2010 г. при применении серий препарата Октагам, раствор для инфузий 50 мг/мл, обусловил необходимость тщательного выяснения причин [34]. Проведенные исследования позволили выявить, что переносимость ИГЧВВ в числе прочего зависит и от того, содержатся ли в препаратах остаточные количества факторов свертывания крови и оказывают ли они влияние на кинетику образования тромбина [10, 22]. Так, тромбогенный потенциал серий препарата Октагам был связан с контаминацией готовой формы фактором свертывания крови XI (XIa) [11, 14]. В связи с этим, Комиссия Европейского директората по качеству лекарственных средств и здравоохранения (EDQM) пересмотрела требования к производству и качеству препаратов ИГЧВВ и утвердила новую редакцию монографии «Иммуноглобулин человека нормальный для внутривенного введения», в соответствии с которой ужесточаются требования к производству препаратов в части доказательства элиминации тромбинообразующих агентов и отсутствия тромбогенного потенциала готовой формы препарата [12]. За тромбогенные осложнения ответственны, главным образом, активированный фактор XI, факторы протромбинового комплекса, калликреин. Важно не столько их содержание, оцененное по количеству антигена, сколько проявляемая активность, а также влияние на эффекторное звено каскада свертывания крови – синтез тромбина. [16, 28, 35, 38]. Для оценки тромбогенного потенциала препаратов такими производителями, как Октафарма Фармацевтика Продуктионсгес, Биотест Фарма, Институто Грифолз, выбраны три основных параметра: изменение кинетики образования тромбина стандартной (нормальной) плазмы крови человека в тесте генерации тромбина; активность прокоагулянтных факторов свертывания крови (II, VII, IX, X, XI); а так же изменение неактивированного частичного тромбопластинового времени стандартной (нормальной) плазмы крови человека [17, 27, 35]. При определении активности прокоагулянтных факторов свертывания крови в препаратах иммуноглобулинов человека особое внимание уделяют их активированным формам, применяя как клоттинговые методы, так и хромогенные. Кроме того, при интерпретации полученных результатов учитывают наличие контаминантов, обладающих антикоагулянтным действием, например, антитромбина III. Тромбогенный потенциал препаратов ИГЧВВ также изучают in vivo методом S. Wessler, моделируя у кроликов сочетание венозного застоя и гиперкоагуляции при введении препарата иммуноглобулина [25, 32, 36].
Таким образом, современные аспекты изучения специфической безопасности препаратов ИГЧВВ охватывают все известные на сегодняшний день потенциальные риски иммуноглобулинотерапии, связанные с негативным влиянием на системы гемостаза, комплемента и калликреин-кининовую. Биологическая природа исходного сырья в сочетании с технологическими особенностями производства ИГЧВВ обуславливает наличие в этих препаратах остаточного количества «нецелевых» белков плазмы крови или конформационно измененных молекул иммуноглобулинов. Соответствие нормативным требованиям по АКА, содержанию полимеров и агрегатов, гемагглютининов, анти-D антител и АП в сочетании с доказанным отсутствием тромбогенного потенциала обеспечивает безопасность их применения. Разработка в РФ национальных стандартов качества, гармонизированных с международными требованиями, обуславливает конкурентоспособность отечественных препаратов ИГЧВВ на фармацевтическом рынке. Нормирование содержания АП и анализ тромбогенного потенциала являются перспективными направлениями повышения их качества.