Одной из главных проблем, препятствующих росту поголовья домашних животных и птиц, являются инфекционные заболевания, в частности пастереллезы [4]. Пастереллез – широко распространенная высококонтагиозная инфекционная болезнь многих видов домашних и диких животных, сопровождающаяся при остром течении признаками септицемии, крупозным воспалением и отеком легких, плевритом, отеками в различных частях тела, а при подостром и хроническом течении гнойно-некротизирующей пневмонией, артритом, маститом, кератоконъюнктивитом, эндометритом и энтеритом.
Согласно сведениям МСХ РК за 2009-2015 гг., одной из основных причин массового падежа сайгаков в 2009-2015 гг. являлась пастереллезная инфекция, а стабильно неблагополучными по пастереллезу являются Западно-Казахстанская, Восточно-Казахстанская и Алматинская области [5].
Научный и практический интерес к пастереллезу животных обусловлен природной очаговостью, пастереллоносительством переболевших животных, появлению не только единичных случаев заболевания, но и крупных вспышек как среди домашних, так и диких животных [1-2].
В представленной работе отражены данные по изучению культурально-морфологических и биохимических свойств эпизоотических изолятов Pasteurella multocida, выделенных от крупного рогатого скота и сайги. Проведенные исследования позволяют оценить возможность использования полученных культур Pasteurella multocida как для оценки иммуногенности существующих вакцин, так и для применения их в качестве основы для разработки рекомбинантных вакцин.
Материалы и методы исследований
В опытах использовали следующие изоляты и штамм Pasteurella multocida:
1) изолят, выделенный из патологического материала от сайгака и освеженный на телятах в 1988 г. (получен из лаборатории коллекции микроорганизмов НИИПББ);
2) изолят, выделенный из патологического материала от крупного рогатого скота из Алматинской области в 2016 г.;
3) в качестве контроля использовали мутантный штамм Pasteurella multocida AroA (Коллекционный номер/B-0050/L), полученный в 2013 г. и депонированный в музее НИИПББ.
Для освежения и повышения вирулентных свойств изучаемых изолятов проводили шесть последовательных пассажей через организм белых беспородных мышей массой 16-18 г путем заражения подкожно в область спины 18 часовой бульонной культурой, в объеме 0,5 см3.
При изучении культурально-морфологических свойств выделенных чистых культур штаммов Pasteurella multocida использовали питательные среды BHIA (Brain heart infusion agar) и BHIB (Brain heart infusion broth). Посевной материал инкубировали в биологических пробирках и чашках Петри при 37 °С в течение 18-24 ч.
Морфологию клеток определяли путем световой микроскопии, мазки-отпечатки окрашивали по методу Грама. Биохимические свойства пастерелл изучали методом их гликолитической активности путем высева на средах Гисса с использованием различных углеводов и последующим инкубированием при 37 °С в течение 24 ч. О ферментации углеводов судили по изменению окраски среды.
Каталазный тест проводили путем смешивания на предметных стеклах, нанося каплю раствора каталазы на бакмассу. Образование пузырьков газа отмечали как положительный результат.
Для полного подтверждения полученных данных проводили биохимический тест с использованием набора ЭНТЕРО-Рапид 24 (Чехия), для постановки теста использовали суточную культуру вышеуказанных образцов, выращенных на BHIA. Учет результатов проводили, используя цветную шкалу набора по окрашиванию проб в лунках.
Результаты исследования и их обсуждение
При посеве изолята Pasteurella multocida, выделенного от КРС на BHIА, через 24 ч культивирования формируются круглые, выпуклые, с гладкой влажной поверхностью прозрачные и полупрозрачные колонии с ровными краями диаметром до и более 2,5 мм.
При культивировании изолята, выделенного от сайгака, через 18-24 ч инкубации наблюдается рост просвечивающих круглых, с ровными краями, гладкой поверхностью колоний слизистой консистенции, диаметром до 2 мм. В проходящем свете 24 ч культура имеет прозрачные края янтарного цвета с слегка затемненным центром. Результаты исследований представлены на рисунке.
В пробирках с жидкой питательной средой BHIB при выращивании изучаемых культур пастерелл во всех случаях наблюдали образование слизистого осадка, которые при встряхивании поднимались в виде характерной косички, что также свидетельствует о принадлежности к пастереллам.
По результатам проведенных исследований установлено, что существенной морфологической особенностью пастерелл являются временные различия в величине и цвете колоний, а также скорости роста на питательных средах.
|
|
|
|
а) изолят Pasteurella multocida, выделенный от КРС |
б) изолят Pasteurella multocida, выделенный от сайги |
Морфологические свойства колоний пастерелл, выделенных из патологического материала КРС и сайгака
Таблица 1
Исследование гликолитической активности пастерелл на средах Гисса
|
Углеводы/спирты |
Испытанные культуры пастерелл |
||
|
от КРС |
от сайги |
штамм AroA, контроль |
|
|
Маннит |
+ |
+ |
+ |
|
Дульцит |
- |
- |
- |
|
Глюкоза |
+ |
+ |
+ |
|
Лактоза |
- |
- |
- |
|
Сахароза |
+ |
+ |
+ |
|
Инозит |
+ |
+ |
+ |
|
Раффиноза |
- |
- |
- |
Примечания: 1 «+» – положительная реакция, 2 «-» – отрицательная реакция
Таблица 2
Результаты биохимического теста для идентификации Pasteurella multocida
|
Использованные тесты |
Испытанные культуры пастерелл |
||
|
От КРС |
От сайги |
штамм AroA, контроль |
|
|
1 |
2 |
3 |
4 |
|
Indole |
+ |
+ |
+ |
|
Lysine |
(-) |
(-) |
(-) |
|
Otnithine |
d |
d |
d |
|
Urease |
(-) |
(-) |
(-) |
|
Sucrose |
+ |
+ |
+ |
|
Sorbitol |
d |
d |
d |
|
Trehalose |
+ |
+ |
+ |
|
Glucose |
+ |
+ |
+ |
|
Pyrrolidonylamidase |
(-) |
(-) |
(-) |
|
Esculin |
(-) |
(-) |
(-) |
|
Cellobiose |
(-) |
(-) |
(-) |
|
Meliobiose |
(-) |
(-) |
(-) |
|
Salicin |
(-) |
(-) |
(-) |
|
Mannose |
+ |
+ |
+ |
|
Maltose |
(-) |
(-) |
(-) |
|
Raffinose |
(-) |
(-) |
(-) |
|
Aceton |
(-) |
(-) |
(-) |
|
Phenylalanine |
(-) |
(-) |
(-) |
|
Malonate |
(-) |
(-) |
(-) |
|
β-Galactosida |
d |
d |
d |
|
β-Glucuronidase |
(-) |
(-) |
(-) |
|
α-Galactosidase |
d |
d |
d |
|
β-Xylosidase |
d |
d |
d |
|
N-acetyl-β-D-glucosaminidase |
(+) |
(+) |
(+) |
Примечания: 1 «+» – 80-100 % положительная реакция, 2 «(+)» – 70-79 % положительная реакция, 3 «d» –вариабельная реакция, 4 «(–)»– 16-30 % отрицательная реакция, 5 «–» – 0-15 % отрицательная реакция.
Морфология клеток пастерелл. Морфологию клеток изучали посредством световой микроскопии. По данным литературы, характерной особенностью данного микроорганизма является биполярность при окрашивании мазков [6]. В изучаемых культурах Pasteurella multocida, неоднократно пересеваемых на плотной питательной (BHIА) и жидкой (BHIB) средах, микроб наиболее часто имеет вид коккообразной палочки, диплококка, расположенных чаще всего отдельно, но встречались парные, групповые скопления и цепочки из коротких палочек разной длины.
При изучении вирулентных свойств испытуемых изолятов, с повышением пассажного уровня отмечали снижение сроков гибели мышей от 24 ч до 18-20 ч, при этом через 12-14 ч после заражения лабораторных животных наблюдали угнетение, учащение дыхания, малоподвижность и взъерошенность волосяного покрова.
В результате вскрытия мышей обнаруживали патологические изменения во внутренних органах: легкие гиперемированы, кровоизлияния на эпикарде сердца, под серозной оболочкой печени, селезенки, геморрагическое воспаление кишечника. При микроскопии мазков-отпечатков, сделанных из крови и органов (сердца, печени, почки, селезенки) лабораторных животных экспериментально зараженных изучаемыми изолятами Pasteurella multocida, в поле зрения встречались грамотрицательные палочки, чаще овоидной формы. Средняя часть бактерийных клеток окрашена бледнее, чем концы. Из органов павших мышей были выделены чистые культуры пастерелл.
После восстановления вирулентных свойств пастерелл проводили эксперименты по изучению биохимических свойств путем высева в биологические пробирки на среды Гисса, постановки каталазного теста и с использованием набора ЭНТЕРО-Рапид 24. Данные по изучению гликолитической активности выделенных чистых культур Pasteurella multocida от КРС и сайги оценивали по изменению цвета в пробирках со средами. В качестве контроля использовали мутантный штамм Pasteurella multocida AroA, полученные результаты представлены в табл. 1.
Данные табл. 1 свидетельствуют о ферментации пастереллами углеводов и спиртов: маннит, глюкоза, сахароза, инозит, ксилоза, кроме пробирок содержащих дульцит, лактозу и раффинозу.
Параллельно проведенный каталазный тест показал положительный результат. Полученные результаты позволяют отнести изучаемые пастереллы к виду Pasteurella multocida, которые согласуются с данными В.И. Покровского [3].
На конечном этапе экспериментов проводили биохимический тест с использованием набора ЭНТЕРО-Рапид 24, результаты показаны в табл. 2.
Из данных, представленных в табл. 2, можно сделать вывод, что при биохимическом тесте с использованием набора ЭНТЕРО-Рапид 24 оба проверяемых образца и контроль дали положительный результат на индол, сахарозу, трегалозу, глюкозу, маннозу и N-acetyl-β-D-glucosaminidase. При этом пробы были окрашены: с индолом в розовый, сахарозой – желто-зеленый, трегалозой, глюкозой, маннозой и N-acetyl-β-D-glucosaminidase – желтый цвет. Изменение цвета при проведении биохимического теста с использованием набора ЭНТЕРО-Рапид 24 свидетельствует о положительной реакции, что является маркерным признаком для Pasteurella multocida [7].
Заключение
Пастереллы, изолированные из патологического материала от КРС и сайги, после шести последовательных пассажей на лабораторных животных вызывают гибель через 18-20 ч, что доказывает их высокую вирулентность.
На основании проведенных исследований можно сделать вывод, что чистые культуры Pasteurella multocida, выделенные из патологического материала крупного рогатого скота и сайгака, образуют колонии S-формы и позволяют отнести их к роду Pasteurella, виду Pasteurella multocida.
Выделенные культуры Pasteurella multocida могут быть использованы для оценки иммуногенности существующих вакцин и применения их в качестве основы для разработки рекомбинантных вакцин.