Scientific journal

International Journal of Applied and fundamental research

ISSN 1996-3955

ИФ РИНЦ = 0,593

Оценка общей концентрации микроорганизмов является обязательным этапом стандартизации бактериальных взвесей как при производстве и контроле качества ряда иммунобиологических лекарственных препаратов (ИЛП), так и при выполнении других работ в области микробиологии. Определение общей концентрации микроорганизмов может быть проведено прямыми (подсчет в счетной камере) и непрямыми (визуальный, нефелометрия) методами [4, 5]. Государственная Фармакопея РФ XIII издания при реализации визуального метода в качестве стандартного образца допускает использование Международного стандартного образца (МСО) мутности ВОЗ (International Reference Preparation of Opacity 1976, NIBSC) и отраслевого стандартного образца мутности бактериальных взвесей (далее – ОСО мутности) (1976, ГИСК им. Л.А. Тарасевича; 2011, ФГБУ «НЦЭСМП» МЗ РФ) [4, 7].

Изучение стабильности материала ОСО мутности показало, что в течение срока годности (1 год) происходит уменьшение в пределах 10 % значения оптической плотности, показателя, по которому стандартизуют ОСО мутности [9]. Изменение мутности стандартного образца может служить дополнительным источником ошибок при визуальном определении общей концентрации микробных клеток и, в конечном итоге, влиять на качество препаратов.

Актуальность работы обусловлена тем, что ОСО мутности применяют для стандартизации АКДС вакцины, входящей в Национальный календарь профилактических прививок; чумной, туляремийной, бруцеллезной вакцин, входящих в календарь прививок по эпидемическим показаниям, а также препаратов группы бактериофагов (более 10 наименований). ОСО мутности используют также при аттестации отраслевых стандартных образцов (ОСО) для оценки специфической активности: чумной вакцины (ОСО 42-28-392), бруцеллезной вакцины (ОСО 42-28-396), туляремийной вакцины (ОСО 42-28-398), гистаминсенсибилизирующей (ОСО 42-28-87) и лейкоцитозстимулирующей (ОСО 42-28-89) активности коклюшной вакцины [1, 2, 3, 6, 8].

Цель исследования – оценить влияние допускаемых различий в пределах 10 % оптической плотности ОСО мутности на результаты определения общей концентрации микробных клеток визуальным методом.

В процессе выполнения работы необходимо было решить следующие задачи:

– определить промежуточную прецизионность результатов подсчета клеток методом микроскопии в камере Горяева;

– оценить промежуточную прецизионность определения общей концентрации микробных клеток в бактериальных взвесях с использованием ОСО мутности и МСО мутности ВОЗ;

– определить общую концентрацию микроорганизмов в микробных взвесях, приготовленных с использованием ОСО мутности, а также экспериментальных образцов ОСО мутности, оптическая плотность которых соответствует предельно-допустимым (минимальному и максимальному) значениям оптической плотности, различными методами: микроскопии и высева на плотную питательную среду.

Материалы и методы исследования

Объекты исследования. Для исследования использовали:

– ОСО мутности, разработанный в ГИСК им. Л.А. Тарасевича и производимый в ФГБУ «НЦЭСМП» Минздрава России, по оптимизированной технологии [7];

– контрольный штамм E. coli 18 и вакцинные штаммы B. abortus 19 BА, Y. pestis EV;

– МСО мутности ВОЗ: 5th International Reference Preparation of Opacity, 10 МЕ (5th IRP, 76/522).

Подготовка микроорганизмов.

Подготовку вакцинных штаммов Y. pestis ЕV и B. abortus 19 BА проводили в соответствии с НД на соответствующие препараты [6].

Для подготовки штамма E. coli 18 в ампулы с лиофилизированной культурой пипеткой вносили по 1 мл 0,9 % раствора натрия хлорида, и после растворения высевали пипеткой в пробирку с бульоном Хоттингера. Посевы инкубировали при температуре (37 ± 1) °С в течение 20 ± 2 ч. Затем бактериологической петлей высевали на чашку Петри с агаром Хоттингера. Посевы инкубировали при температуре (37 ± 1) °С в течение 20 ± 2 ч.

Выросшие культуры смывали 0,9 % раствором натрия хлорида. Полученные суспензии микроорганизмов визуальным методом [4] доводили до мутности, соответствующей 10 МЕ, используя ОСО мутности, экспериментальные образцы ОСО мутности и МСО мутности ВОЗ, затем разделяли на две части. Одну часть использовали для определения числа жизнеспособных клеток. Вторую часть – для подсчета общего числа клеток после инактивации.

Инактивацию бактериальных взвесей для подсчета в камере Горяева осуществляли в соответствии с СП 1.3.1285-03 «Безопасность работы с микроорганизмами I-II групп патогенности (опасности)».

Для оценки общей концентрации микробных клеток в исследуемых инактивированных бактериальных взвесях использовали разведение 1:100. Для этого из пробирки с исследуемой взвесью, мутность которой при визуальном сравнении довели до мутности 10 МЕ ОСО мутности, делали последовательные десятикратные разведения: отбирали 0,5 мл и добавляли 4,5 мл 0,9 % раствора натрия хлорида (разведение 1:10). Затем из этой пробирки отбирали 100 мкл исследуемой взвеси и добавляли 900 мкл 0,9 % раствора натрия хлорида (разведение 1:100). Инактивированные исследуемые бактериальные взвеси перемешивали на магнитной мешалке для получения равномерного распределения клеток во взвеси.

Из пробирок с разведенными бактериальными взвесями отбирали 10 мкл, наполняли камеру Горяева и помещали в микроскоп Axio Scope А1 с фазово-контрастным устройством при 400-кратном увеличении (объектив 40, окуляр 10). Концентрацию микроорганизмов рассчитывали в соответствии с ОФС 1.7.2.0008.15 [4,6].

Определение количества жизнеспособных микробных клеток методом высева на поверхность плотной питательной среды. Взвеси микроорганизмов, доведенные до мутности 10 МЕ по соответствующим образцам ОСО мутности, последовательными десятикратными разведениями от 10^-1 до 10^-6, доводили до разведения 1000 м.к./мл. Из последнего разведения высевали по 0,1 мл взвеси на 5 чашек Петри (расчетное число ≈ 100 м.к. на чашку) с соответствующими питательными средами, которые помещали в термостат при температуре (37 ± 1) °С.

Учет результатов определения количества жизнеспособных клеток проводили: для бруцеллезного микроба – через 5 сут.; чумного микроба и кишечной палочки – через 4 сут.

Для расчета концентрации жизнеспособных микробных клеток среднее арифметическое количества колоний на чашке Петри (n = 5) умножали на степень разведения культуры (х10⁷).

Общую концентрацию микробных клеток и концентрацию жизнеспособных клеток выражали в млрд. м.к./мл.

Статистическую обработку данных проводили, рассчитывая среднее арифметическое значение (Хср), стандартное отклонение (S) и относительное стандартное отклонение (коэффициент вариации, CV). Статистическую значимость различий экспериментальных данных оценивали с помощью критериев Стьюдента и Фишера.

Результаты исследования и их обсуждение

Определение промежуточной прецизионности результатов подсчета клеток в камере Горяева (метод микроскопии)

Для определения промежуточной прецизионности результатов подсчета клеток в камере Горяева были проведены определения количества клеток кишечной палочки (E. Coli 18) в пяти повторностях. Одна повторность – подсчет в 2-х сетках камеры Горяева. Подсчет проводили в один день двумя операторами, каждым из которых были подсчитаны по 5 полей зрения в каждой сетке камеры Горяева (всего 10 больших квадратов). Промежуточную прецизионность рассчитывали как относительное стандартное отклонение результатов измерений (коэффициент вариации). Результаты приведены в табл. 1.

Из данных, приведенных в табл. 1, следует, что коэффициент вариации количества подсчитанных операторами клеток в больших квадратах сетки одной камеры составляет от 11 до 34 %. Это означает, что исследуемая взвесь имеет неравномерное распределение микроорганизмов в поле камеры. Для обеспечения достоверности подсчета количества клеток с помощью камеры Горяева необходимо проводить подсчет не менее, чем в 10 больших квадратах одной камеры двумя операторами или не менее, чем в 20 больших квадратах одной камеры одним оператором [4].

Значения общей концентрации микробных клеток, рассчитанные для каждой повторности ((0,81 ± 0,22)·10⁹ м.к./мл; (0,93 ± 0,24)·10⁹ м.к./мл; (0,78 ± 0,13)×10⁹ м.к./мл; (0,83 ± 0,23)·10⁹ м.к./мл; (0,88 ± 0,11)·10⁹ м.к./мл соответственно), принадлежат интервалу значений общей концентрации, установленному для кишечной палочки: (0,91 ± 0,20)·10⁹ м.к./мл или (от 0,71 до 1,11)·10⁹ м.к./мл (см. табл. 2). При этом относительное стандартное отклонение находится в диапазоне от 12 % до 28,2 %. Коэффициент вариации среднего значения количества клеток в одном большом квадрате камеры Горяева каждой из 5 повторностей не превысил 7,2 %, что свидетельствует об удовлетворительной точности определения количества микробных клеток в камере Горяева.

Таблица 1

Результаты подсчета клеток c целью оценки промежуточной прецизионности методики подсчета клеток в камере Горяева (метод микроскопии)

Примечание: – среднее количество клеток в одном большом квадрате камеры Горяева, рассчитанное для каждой повторности (n = 20);

,общ – среднее количество клеток в одном большом квадрате камеры Горяева, рассчитанное по объединенным данным (n = 5);

CVобщ – коэффициент вариации, характеризующий промежуточную прецизионность методики подсчета клеток в камере Горяева, рассчитанный по объединенным данным;

CVоп1 – коэффициент вариации оператора № 1;

CVоп2 – коэффициент вариации оператора № 2.

Таблица 2

Результат определения общей концентрации микробных клеток кишечной палочки во взвесях, соответствующих 10 МЕ по ОСО и МСО мутности ВОЗ

Примечание: Ncp – среднее количество клеток в одном большом квадрате;

C – концентрация микробных клеток, соответствующая 10 МЕ;

S – стандартное отклонение;

CсрОСО, МСО – среднее значение концентрации микробных клеток, соответствующая 10 МЕ, по ОСО мутности и МСО мутности ВОЗ;

Cср– среднее значение концентрации микробных клеток, соответствующая 10 МЕ, по результатам всех испытаний.

Оценка промежуточной прецизионности определения общей концентрации микробных клеток в бактериальных взвесях с использованием ОСО мутности и МСО мутности ВОЗ

Испытания проводили в условиях промежуточной прецизионности по фактору «время» 2 оператора (2 блока измерений). Каждый оператор провел оценку дважды в один момент времени. Общее число измерений n = 4. Результаты определения общей концентрации микробных клеток во взвесях кишечной палочки приведены в табл. 2.

Значение t-критерия Стьюдента, рассчитанное по экспериментальным данным tэксп = 0,34 для исследуемых взвесей кишечной палочки, не превышает табличное tтабл = 3,18 для уровня доверительной вероятности P ≥ 0,95 и числа степеней свободы v = 3. Следовательно, различия статистически незначимы и мутность взвесей кишечной палочки, приготовленных с использованием серии ОСО, соответствует МСО мутности ВОЗ. Значение концентрации, рассчитанное по результатам измерений, составляет (0,91 ± 0,20) 109 м.к./мл. Относительное стандартное отклонение полученных результатов не превышает 25 %.

Оценка общей концентрации микробных клеток и жизнеспособных клеток во взвесях кишечной палочки, чумного и бруцеллезного микробов в зависимости от оптической плотности ОСО мутности

В связи с тем, что для ОСО мутности в течение срока годности допускается уменьшение аттестованного значения оптической плотности (0,46), то необходимо экспериментально подтвердить отсутствие влияния изменения оптической плотности на 10 % на результат визуального определения общей концентрации микробных клеток. Для этого провели подсчет в камере Горяева микробных клеток микроорганизмов во взвесях E. coli 18, B. abortus 19 BА и Y. pestis EV, приготовленных с использованием серий ОСО мутности: сер S-4 (изг. 12.2013 г/) и двух экспериментальных серий ЭВ и ЭН, значения оптической плотности которых составляет ± 5 % от установленного при метрологической аттестации значения (0,46) [11]. Значение оптической плотности серии ЭВ соответствует верхнему пределу (0,482), а серии ЭН – нижнему пределу (0,438) установленного диапазона значений оптической плотности ОСО мутности, т.е. разница по оптической плотности в образцах ЭВ и ЭН составляет 10 %. Полученные результаты и их статистическая обработка приведены в табл. 3.

Как следует из табл. 3, несмотря на некоторые различия средних значений общей концентрации микробных клеток, для всех микроорганизмов экспериментальное значение Fэксп критерия Фишера меньше табличного Fтабл. Для всех исследованных микроорганизмов различие значений количества жизнеспособных клеток для трех вариантов приготовленных взвесей также статистически недостоверно. Различие значений общей концентрации микроорганизмов и количества жизнеспособных микробных клеток для всех исследованных взвесей, в том числе соответствующих максимально допустимой разнице значений оптической плотности ОСО мутности (10 %), статистически незначимо с доверительной вероятностью Р ≥ 0,95. Это означает, что при приготовлении бактериальных взвесей с концентрацией, эквивалентной 10 МЕ, разница оптической плотности ОСО мутности, не превышающая 10 %, не влияет на общую концентрацию микроорганизмов в приготовленных взвесях.

Таблица 3

Определение концентрации микробных клеток во взвесях кишечной палочки, чумного и бруцеллезного микробов, доведенных до мутности 10 МЕ с использованием ОСО мутности и экспериментальных образцов ОСО мутности методами микроскопии и высева на поверхность плотной питательной среды