Пион молочноцветковый (Paeonia lactiflora), белоцветковый или китайский произрастает в Монголии, Китае, Приморье, Забайкалье по склонам сопок, по берегам рек, в зарослях дуба монгольского. Наибольшее количество травянистых пионов произошло от молочноцветкового. В отличие от других дикорастуших травянистых пионов Р.lactiflora стоит на одном из первых мест по устойчивости к засухе, морозам и серой гнили. Он широко используется в озеленении, а настои корневищ широко применяют в китайской медицине в качестве болеутоляющего, противосудорожного, спазмолитического, противовоспалительного и нормализующего кровяное давление средства [1,6]. Ранее было показано, что в корнях пионов содержится гепариноподобный компонент с низкой молекулярной массой (до 6 кDa) [2,4]. Известно, что стандартный гепарин, полученный из тканей животных, замедляет процессы фибринообразования за счет присущего ему антикоагулянтного действия [7,8]. В клинической практике применяются высоко- или низкомолекулярные гепарины в основном животного происхождения. Однако, высокомолекулярный гепарин при передозировке имеет побочное действие в виде тромбоцитопений, «рикошетных эффектов» или геморрагий [5]. Низкомолекулярные формы гепаринов практически не имеют указанных отрицательных последствий на организм, но они в основном иностранного производства. До сих пор продолжается поиск безопасных отечественных антикоагулянтов без побочных отрицательных воздействий на организм. К таким антикоагулянтам могут относиться вещества растительной природы. Поэтому проблема изучения антикоагулянтов растительного происхождения и исследование механизма их действия на свертывание крови актуальны и в настоящее время.
Цель работы заключалась в разработке оптимального способа получения экстракта из корней пиона молочноцветкового (Paeonia lactiflora), исследовании его влияния на различные звенья гемостаза и расшифровке возможных механизмов его антикоагулянтного действия.
Материалы и методы исследования
В работе использовали свежие корни пиона молочноцветкового (КПМ), выращенного в Ботаническом саду МГУ имени Ломоносова. Мы разработали наиболее оптимальный способ получения антикоагулянтного экстракта из КПМ, для чего корни промывали водопроводной водой, высушивали при 37С в течение 24 часов, освобождали от коры, а сухую сердцевину растирали в фарфоровой ступке не менее 20–30 мин. Далее взвешивали препарат и для получения его начального 5 %-го раствора использовали 0,85 %-й раствор NaCl. Через 20–24 ч стояния раствора пиона при 37С его подвергали центрифугированию в течение 10 мин при 3000 об./мин. Супернатант (экстракт) использовали в дальнейших экспериментах.
Исследовали влияние полученного экстракта из пиона (ЭП) на гемостазиологические параметры [3] в условиях in vitro, для чего к крови или к плазме добавляли ЭП из расчета на 0.3 мл крови или плазмы 0.02 мл ЭП. Инкубировали эти растворы в течение не менее 3-5 мин и записывали следующие параметры тромбоэластографии (ТЭГ) на приборе Hellige (Германия) – «R» (фаза тромбопластино- и тромбинобразования), «К «(фаза фибринообразования), «ma» (максимальная амплитуда, свидетельствующая об изменении /повышении или снижении/ концентрации фибриногена), «t» (при удлинении свидетельствует об активации антикоагулянтной активности), «S»(константа синерезисa = R + t, свидетельствует об уплотнении сгустка). «Т» (тотальная константа свертывания) , «Е» (эластичность сгустка, отражающая плотность сгустка). Кроме того, на приборе анализатор свертывания крови АСКа-2-01 АСТРА (Россия) определяли протромбиновое время (ПВ), тромбиновое время (ТВ) и активированное частичное тромбопластиновое время (АЧТВ) [3] для характеристики внешнего, внутреннего и общего путей свертывания крови. В экспериментах использовали лабораторных белых крыс–самцов массой тела 180–200 г, из v,jugularis которых брали кровь с использованием в качестве консерванта 3.8 %–ный лимоннокислый натрий в соотношении 9:1 (для тромбоэластографического метода), которую затем подвергали центрифугированию при 2000 q в течение 10–12 мин для получения бестромбоцитарной плазмы. Эта плазма использовалась для определения АЧТВ, ПВ, ТВ.
Статистическая обработка данных проведена согласно методу Стьюдента.
Результаты исследования и их обсуждение
Установлено, что ЭП в начальной концентрации 5 % по всем тестам обнаруживает значительную антикоагулянтную активность, превышающую контрольные значения в 1.8-2.6 раза. По данным ТЭГ выявлено по сравнению с контролем, что показатель «R» удлиняется в 1.8 раза, что свидетельствует об ингибирующем действии ЭП в процессах образования тромбина и фактора Ха, показатель «K» при этом удлиняется в 2.6 раза, что, во-первых, указывает на возникновение гипокоагуляции, обусловленной антитромбиновым потенциалом крови, во-вторых, на участие ЭП в предотвращении образования фибринового сгустка. Показатель «K», как известно, зависит от концентрации образующегося тромбина, концентрации и функциональной полноценности фибриногена и факторов протромбинового комплекса, которые, судя по полученному результату, значительно снижены. Показатель «Т» ТЭГ в опытных пробах удлиняется в 2.27 раза, что указывает на активацию антикоагулянтной активности крови под влиянием ЭП. Константа синерезиса, показатель «S» ТЭГ, в опыте превышает контрольный уровень в 2.3 раза, т.е. процесс уплотнения сгустка в опыте происходит значительно медленнее контроля за счет антикоагулянтного действия ЭП (таблица).
Гемостазиологические параметры после инкубации экстракта из пиона молочноцветкового с кровью крыс (средние данные из 7 проб в каждой группе) (М±m)
|
Параметры гемостаза |
Контроль (0.85 %-ный NaCl) |
Опыт (5 %-й экстракт из корней P.lactiflora) |
|
«R»ТЭГ,мин |
1.56 ± 0.4 |
2.85 ± 0.3** |
|
«K»ТЭГ, мин |
7.5 ± 0.9 |
19.5 ± 1.2** |
|
«ma» ТЭГ, см |
2.2 ± 0.2 |
2.0 ± 0.1 |
|
«t» ТЭГ. мин |
3.0 ± 0.5 |
5.4 ± 0.9* |
|
«T» ТЭГ, мин |
12.0 ± 1.3 |
27.3 ± 1.5** |
|
«S» ТЭГ, мин |
10.5 ± 1.1 |
24.9 ± 2.2** |
|
ПВ,сек |
36.7 ± 2.3 |
63.3 ± 1.0** |
|
АЧТВ, с |
39.0 ± 1.1 |
55.4 ± 0.9** |
|
ТВ разведенное, с |
43.5 ± 2.8 |
88.2 ±2.6** |
Примечание. Статистические показатели рассчитаны относительно соответствующих проб контроля. Обозначения: **р < 0.01; *p < 0.05.
Нами установлено, что показатель ПВ, характеризующий внешний путь свертывания и отражающий чувствительность к дефициту факторов протромбинового комплекса (VII, X, V, II) в опытных пробах (ЭП) превышал контрольные значения в 1.7 раза. Эти данные свидетельствуют, что механизм антикоагулянтного действия ЭП обусловлен его ингибированием факторов протромбинового комплекса – тромбина, фактора Ха, в меньшей степени факторов V и VII. Дополнительный тест по влиянию ЭП на изменение АЧТВ, характеризующий внутренний путь свертывания, показал удлинение АЧТВ в опыте по сравнению с контролем в 1.4 раза. Это указывает на влияние ЭП на начальный этап внутреннего механизма свертывания и показывает дефицит всех плазменных факторов свертывания, кроме фактора VII. Установлено также, что ТВ в опыте удлиняется в 2.0 раза по сравнению с контролем, что подтверждает полученные нами данные ТЭГ по ингибированию активности фермента тромбина под влиянием ЭП. Таким образом, антикоагулянтные эффекты ЭП связаны в основном с ингибированием активности тромбина, фактора Ха и других факторов свертывания крови, участвующих в образовании фибрина. Кроме того, это обусловлено и блокадой других факторов внутреннего механизма свертывания крови, но уже в меньшей степени.
Поскольку известно, что низкомолекулярные формы гепариноподобных компонентов присутствуют в корнях пионов [2], а в клинике для борьбы с тромботическими осложнениями без проявления побочного действия используется низкомолекулярный гепарин, но только животного происхождения, то весьма перспективными могут быть исследования растительных гепариноподобных препаратов с антикоагулянтной активностью.
Заключение
Разработан эффективный метод получения антикоагулянтного экстракта из корней пиона молочноцветкового. Метод предусматривает термостатирование (37С) при высушивании корней и получении экстракта. Установлено наличие в экстрактах высокой антикоагулянтной активности в условиях in vitro, что доказано различными коагулологическими методами (тромбоэластографическим, тестами АЧТВ, ПВ,ТВ). На основании полученных данных раскрыт возможный механизм антикоагулянтного действия экстракта, который заключается в ингибировании всех фаз процесса свертывания крови – образования протромбинового комплекса, в том числе фактора Ха, тромбина, а также процессов фибринообразования. Таким образом, действие антикоагулянтного растительного экстракта начинается уже с первых стадий процесса свертывания крови и протекает до конечного этапа – стадии фибринообразования, что указывает на его высокий антитромботический эффект. Это его действие соответствует эффектам низкомолекулярных форм гепарина животного происхождения.