Scientific journal

International Journal of Applied and fundamental research

ISSN 1996-3955

ИФ РИНЦ = 0,593

Бета-лактамные антибиотики (БЛА), в настоящее время являются наиболее широко используемым классом антибактериальных средств для лечения тяжелых инфекционных патологий, включая госпитальные инфекции. Основным фактором, ограничивающим клиническую эффективность БЛА, является способность микроорганизмов вырабатывать гидролитические ферменты бета-лактамазы, разрушающие их структуру и придающие устойчивость бактериям ко многим, а в некоторых случаях ко всем β-лактамным антибиотикам [7]. Прогрессирующее увеличение устойчивости к антибиотикам, опосредованное продукцией β-лактамаз, наблюдается во многих странах и ведет к многочисленным вспышкам инфекций. [2,8].

β-лактамазы расширенного спектра (БЛРС) впервые были выявлены в середине 1980-х, в последние десятилетия устойчивость к БЛА за счет продукции БЛРС достигла масштабов эпидемии [7]. Синтез ферментов БЛРС обеспечивает бактериям устойчивость к β-лактамным препаратам широкого спектра, таким как пенициллины, азтреонам, а также к цефалоспоринам первого, второго и третьего поколения. Гены БЛРС локализуются на хромосомах или на мобильных генетических элементах плазмидах и транспозонах, это является важным драйвером возрастания резистентности в результате горизонтального переноса и клональной экспансии устойчивых штаммов [10].

Наиболее распространенными во всем мире возбудителями инфекций с множественной лекарственной устойчивостью являются бактерии семейства Enterobacteriaceae, преимущественно Klebsiella pneumonia. K. pneumoniae является важным патогеном нозокомиальных инфекций человека и наиболее распространенными грам – отрицательными бактериями с множественной лекарственной устойчивостью во всем мире. БЛРС- продуцирующие K. pneumoniae вызывают инфекции ассоциированные с мочевыводящей системой, желудно-кишечным и респираторным трактом [6].

Появление полирезистентных патогенов в амбулаторных условиях представляет собой серьезную проблему в борьбе с инфекциями и является фактором риска для дальнейшего распространения множественной лекарственной устойчивости к различным классам антибиотиков [8]. Исследования формирования и пространственной локализации антибиотикорезистентности, как многоцентровые, так и локальные являются важнейшим мероприятием по сдерживанию дальнейшего распространения патогенных организмов.

Цель данного исследования заключалась в выявлении БЛРС – продуцирующих штаммов Klebsiellа pneumoniae у амбулаторных пациентов, изучении их чувствительности к антибиотическим препаратам различных групп и распространенности генов бета-лактамаз расширенного спектра blaTEM-1,2, bla CTX-М.

Материалы и методы исследования

Для исследования были отобраны 36 изолятов Klebsiellа pneumoniae, выделенных из различных локусов организма амбулаторных пациентов г. Ростова-на-Дону в период с апреля по октябрь 2015 г. Критерием включения изолятов в исследование было снижение чувствительности хотя бы к одному из β-лактамных антибиотических препаратов до уровня, предлагаемого Национальным комитетом по клиническим лабораторным стандартам США – CLSI [5].

Чувствительность к антибиотическим препаратам определялась диско-диффузионным методом согласно рекомендациям и критериями, изложенным в Методических указаниях по определению чувствительности микроорганизмов к антибактериальным препаратам [1].

Видовую идентификацию изолятов проводили с использованием тест-систем MIKRO-LA-TEST (PLIVA-Lachema Diagnostika s.r.o., Чехия) и автоматического бактериологического анализатора «VITEK-2 compact» (BioMerieux, Франция).

Для обнаружения генов-маркеров резистентности к пенициллинам blaTEM-1,2 и цефалоспоринам blaСТХ-M изоляты исследовали с помощью ПЦР. Для этого использовали ПЦР наборы ООО НПО “Литех” для обнаружения генетически обусловленной устойчивости микроорганизмов к антибиотикам формата one step.

ДНК из суточной культуры исследуемых изолятов выделяли с помощью набора «ДНК-экспресс» (ООО НПФ «Литех», г. Москва), согласно инструкции.

ПЦР проводилась в амплификаторе “Терцик“ (ДНК технологии, Россия) в соответствии с протоколом производителя. Продукты амплификации разделяли методом горизонтального электрофореза в 2 % агарозном геле. Анализ электрофореграмм проводили на трансиллюминаторе GelDoc (BioRad).

Результаты исследования и их обсуждение

Все отобранные для исследования изоляты были протестированы на чувствительность к антибиотикам различных групп: бета – лактамным препаратам пенициллинам (ампициллину, амоксициллину), цефалоспоринам I, II, III, IV поколения (цефазолину, цефуроксиму, цефотаксиму, цефепиму), карбапенемам (имипенему, дорипенему), а также к аминогликозидам (гентамицину) и фторхинолонам (ципрофлоксацину).

Было установлено, что 58.3 % K. pneumoniae устойчивы к цефазолину, цефотаксиму и цефепиму, резистентность к цефуроксиму составила 50 %. у 100 % изолятов зарегистрирована устойчивость к ампициллину, амоксициллину. Все исследованные изоляты оказались чувствительными к имипенему и дорипенему. Результаты представлены в табл. 1.

Таблица 1

Чувствительность изолятов K. pneumoniae к БЛА (n=36)

Среди изолятов был выявлены образцы, обладающие множественной лекарственной устойчивостью не только к БЛА, а также к антибиотикам других групп: гентамицину и ципрофлоксацину – 2 и 3 изолята соответственно.

У части образцов одновременно зарегистрирована полирезистентность к пенициллинам и цефалоспоринам I-IV поколения, т.е. они экспрессируют фенотип БЛРС. Выраженная устойчивость к этим препаратам является следствием наличия у бактерий генов, кодирующих продукцию детерминант устойчивости к БЛА.

В нашем исследовании все изоляты были протестированы на наличие у них генов blaTEM-1,2 bla CTX-М. Результаты анализа генотипов представлены в табл. 2.

Таблица 2

Распределение генов β-лактамаз у K.pneumoniae устойчивых к БЛА

Положительные результаты амплификации blaTEM-1,2 и bla CTX-М зарегистрированы у 11 и 20 исследованных изолятов соответственно, т.о. относительная частота встречаемости bla CTX-М практически в 2 раза выше, чем blaTEM-1,2. при этом у 19.4 % K.pneumoniae обнаружены оба исследуемых гена.

Устойчивость к β-лактамным антибиотикам у бактерий реализуется за счет нескольких механизмов, включая продукцию различных энзимов, изменения конформации пенициллинсвязывающих белков, снижения проницаемости оболочки клетки и активного выведения АБП из микробной клетки (эффлюкса).

В настоящее время внимание исследователей обращено в основном на изучение трех основных групп ферментов бета-лактамаз, относящихся к молекулярному классу а – ТЕМ, SHV и СТХ-М, которые способны расщеплять не только антибиотики пенициллинового ряда и ранние цефалоспорины, но и цефалоспорины III и IV поколений. в каждой из этих гpyпп бета-лактамазы отличаются от основного фермента единичными аминокислотными заменами, которые расширяют спектр их ферментативной активности или приводят к возникновению устойчивости к ингибиторам [4]. у БЛРС-продуцирующих штаммов K. pneumoniae CTX-M является доминирующим, но TEM и SHV ферменты, а также β-лактамазы трех других классов (B, C, D) также детектированы и широко распространены. Резистентность к карбапенемам может ассоциироваться с продукцией карбопенемаз класса A KPCs, класса B металло-β-лактамаз (VIM, IMP, или NDM-1) или класса D OXA-тип энзимов [9].

Большинство субтипов ТЕМ и SHV бета-лактамаз являются БЛРС, способными расщеплять не только антибиотики пенициллинового ряда и ранние цефалоспорины, но и цефалоспорины III и IV поколений. Характерную для БЛРС активность проявляют также все ферменты СТХ-М типа [3].

Результаты анализа фенотипов и генотипов позволили установить, что резистентность к БЛА у 72 % исследованных изолятов ассоцирована с генами β-лактамаз blaTEM-1,2 и bla CTX-М.

В дополнение к БЛРС, устойчивость к бета-лактамам расширенного спектра у Enterobacteriaceae может быть опосредована другими плазмидами и ферментами, закодированными на хромосомах, такими как карбапенемазы и AmpC цефалоспориназы [2]. Многие гены БЛРС располагаются на больших плазмидах, на которых могут также присутствовать детерминанты устойчивости к другим классам антибиотиков к аминогликозидам, тетрациклиамн, сульфаниламидам или фторхинолонам. Это ведет к появлению БЛРС-продуцирующих патогенов с множественной лекарственной устойчивостью. в нашем исследовании также детектированы изоляты, обладающие множественной лекарственной устойчивостью к различным класса антибиотиков: БЛА, аминогликозидам и фторхинолонам.

Заключение

Полученные результаты показывают, что обнаруженная множественная лекарственная устойчивость у амбулаторных изолятов K.pneumoniae связана с производством генов β-лактамаз CTX-M и ТЕМ-1,2 и подтверждают потенциальную роль K.pneumoniae, как резервуара для БЛРС генов и других детерминант резистентности. Наличие патогенов устойчивых к современным антибиотикам не только у госпитализированных, но и у амбулаторных пациентов способствует распространению БЛРС среди здоровых людей, в общественных учреждениях и в окружающей среде.

Исследование выполнено при поддержке Министерства образования и науки Российской федерации в рамках базовой части государственного задания в сфере научной деятельности № 1878 «Разработка фундаментальных аспектов молекулярной диагностики и митохондриальной фармакологии».