Представители Salix L. (Salicaceae) и Spiraea L. (Rosaceae) известны как одни из наиболее полиморфных древесно-кустарниковых растений, широко распространенных в северном полушарии. Наблюдаемые явления межвидовой гибридизации усложняют и без того непростую систематику этих родов.
Цель исследования
Для видовой идентификации и выявления гибридных комбинаций ив и спирей, а также для понимания роли гибридизации в изменчивости и микроэволюции необходимы исследования на стыке ботаники и генетики. В связи с этим нами начаты молекулярно-генетические исследования с целью идентификации видов и межвидовых гибридов Salix и Spiraea.
Материал и методы исследования
Для выделения ДНК с 2-летних побегов ив и спирей собирались молодые неповрежденные листья и сушились в силикагеле. Лабораторные работы по выделению и анализу фрагментов ДНК выполнены в г. Москва в Институте общей генетики РАН им. Н.И. Вавилова. Геномная ДНК выделена с использованием модифицированного CTAB протокола. Для амплификации фрагмента ITS-оперона рибосомальной ДНК (рДНК) использовали праймеры ITS6 и ITS9, разработанные для восточноазиатских видов трибы Spiraea [9] и успешно протестированные нами [8]. Цикл амплификации включал: денатурацию при 94° С в течение 1 минуты, отжиг праймеров при 58° С в течение 50 секунд и элонгацию при 72° С в течение 1 минуты с числом циклов – 30. Полученные ПЦР-фрагменты были очищены набором реагентов для быстрой элюции ДНК из агарозных гелей Diatom DNA Elution. Секвенирование ITS фрагментов проводили в ЗАО «Евроген» в обоих направлениях. Сиквенсы были попарно выравнены в программе BioEdit, множественное выравнивание выполнено в программе ClustalW2 с визуальной проверкой спорных позиций на хроматограммах. Эволюционные исследования выполнены в программе MEGA 6 [10]. Для оценки таксономических различий видов и выявления гибридов выбран регион ITS, включающий межгенные спейсеры ITS1 и ITS2 и ген 5.8S ядерной рибосомальной ДНК. Ядерные последовательности ITS зарекомендовали себя как наиболее востребованные маркеры для видоидентификации и филогенетики растений [2, 4, 6] благодаря ряду преимуществ, среди которых высокая вариабельность, консервативная протяженность, высокая копийность, а также двуродительское наследование [1], обеспечивающее идентификацию недавно возникших гибридов [5]. Молекулярно-генетические исследования дальневосточных ив с применением ITS-региона рДНК впервые для России были проведены В.Ю. Баркаловым, М.М. Козыренко [7]. Результаты работ позволили частично прояснить взаимоотношения видов и секций в подроде Salix, а также выявить родственные связи Chosenia и Toisusu. Высокая схожесть пластидной и ядерной геномных характеристик большинства видов, принадлежащих роду Salix, включенных в анализ, может свидетельствовать о том факте, что они относительно недавно отошли от общего предка или это есть результат пересечения генеалогических линий через гибридизацию.
Нами исследования ив и спирей с использованием ITS-региона проведены впервые для Якутии. Образцы ив и спирей собраны в центральных (окрестности г. Якутска, среднее течение р. Лены), юго-восточных (бассейны рр. Мая, Юдома) и южных (р. Хани, окрестности г. Алдан, пос. Беркакит, Томмот) районах Якутии, а также взяты для анализа из гербарных фондовых материалов ИБПК СО РАН (SASY). Кроме того, образцы ив отобраны в северных (дельта и низовья р. Лены) и северо-восточных (Восточное Верхоянье, Колымская низменность) районах Якутии. Всего для исследования взято 165 образцов ив, составляющих 31 вид, и 25 предполагаемых межвидовых гибридов. Для сравнения также взяты образцы S. alba, S. fragilis, S. caprea из Московской области (окрестности г. Пущино и г. Звенигород), а также образцы S. lanata из Лапландии (гора Пикку-Малла). В данном исследовании проанализировано более 30 образцов спирей, составляющих 6 таксонов, а также включены в анализ дальневосточные и сибирские виды спиреи, изученные нами ранее [3].
Результаты исследования и их обсуждение
Анализ нуклеотидного полиморфизма ITS-региона рДНК рода Salix выявил генетические различия в виде однонуклеотидных замен – трансверсий (табл. 1) у 12 видов, в том числе аутапоморфных. Общая длина анализируемого фрагмента ITS составила 597 позиций, из них 24 вариабельны, 13 позиций филогенетически-информативны. Длина спейсера ITS1 составила 222-223 нуклеотида, ITS2 – 212 нуклеотидов, протяженность гена 5.8s – 163 нуклеотида. Последовательности изученных образцов разного происхождения, принадлежащих к одному виду, оказались идентичны.
Установлено, что методом секвенирования ITS-региона отчетливо идентифицируются виды более древнего подрода Salix, такие, как S. alba, S. fragilis, S. triandra, S. pseudopentandra. Они имеют определенный набор трансверсий, отделяющих их от других видов ив и от близких к ивам тополей. В условиях Якутии S. triandra, S. pseudopentandra внешне не полиморфны, практически не вступают в межвидовые скрещивания, и это может характеризовать их как устоявшиеся в процессе микроэволюции виды. Иная картина наблюдается у подродов Chamaetia и Vetrix – путем анализа нуклеотидного полиморфизма ITS большинство видов не идентифицируется. Удалось в некоторой степени верифицировать 7 видов и установить 2 гибрида: Salix udensis × viminalis и Salix × zhataica = S. brachypoda × S. pyrolifolia. В целом у этих подродов матрица сиквенсов обнаруживает некий парадокс: фенотипически весьма близкородственные односекционные виды имеют разделяющие их транзиции, в то время, как отдаленные разносекционные виды имеют идентичную нуклеотидную последовательность.
Таблица 1
Положение однонуклеотидных замен в спейсерах ITS 1 и ITS 2 рДНК у видов рода Salix
|
ITS 1 |
ITS 1 |
ITS 2 |
ITS 2 |
||||
|
Позиция |
Замена |
Позиция |
Замена |
Позиция |
Замена |
Позиция |
Замена |
|
26 |
T→C |
139 |
C→T |
368 |
Т→С |
540 |
T→C |
|
34 |
C→T |
158 |
T→G |
453 |
C →A |
546 |
C→T |
|
77 |
T→C |
165 |
T→C |
469 |
A→T |
575 |
T→C |
|
81 |
A→T |
171 |
A→C |
526 |
C →T |
581 |
T→A |
Таблица 2
Мутации в области ITS у близких видов Spiraea salicifolia и S. humilis и их предполагаемых гибридов из Якутии
|
Позиция |
Область |
S. salicifolia |
Предполагаемые гибриды |
S. humilis |
|
|
Орбогур |
Лапри |
||||
|
39 |
ITS 1 |
T |
T |
C |
C |
|
92 |
ITS 1 |
T |
C |
T |
C |
|
106 |
ITS 1 |
T |
T |
T |
C |
|
615 |
ITS 2 |
C |
C |
C |
T |
|
627 |
ITS 2 |
T |
T |
T |
C |
|
629 |
ITS 2 |
C |
C |
C |
A |
Таблица 3
Транзиции в области ITS 1 и ITS 2 у видов Spiraea media и S. dahurica и их гибридов из Якутии
|
Позиция |
S. media |
Предполагаемые гибриды |
S. dahurica |
|||
|
Буотама |
Хани |
Юдома |
Ленские столбы |
|||
|
108 |
C |
T |
T |
T |
C |
T |
|
443 |
T |
T |
T |
T |
T |
C |
|
584 |
C |
C |
C |
T |
T |
T |
Для 30 образцов различных видов Spiraea, произрастающих в районах Центральной и Юго-Восточной Якутии, получены фрагменты, включавшие полноразмерный регион ITS 1-5.8s-ITS 2 и частично гены 18S и 26S. Были получены данные, сходные с нашими ранними исследованиями [3]. После выравнивания длина анализируемого фрагмента ITS насчитывала 660 позиций, из них 572 позиции консервативны, 85 вариабельны, но не информативны, 74 позиций оказались филогенетически-информативными. Сравнительное изучение ITS-фрагментов у изученных видов показало наличие как инделей, так и генных точечных мутаций – трансверсий и транзиций. По протяженности, а также по числу константных, вариабельных и филогенетически информативных сайтов спейсер ITS 1 более изменчив. Таксоноспецифичные инсерции/делеции наблюдались как в области ITS 1, так и ITS 2.
Тщательный анализ нуклеотидного полиморфизма ITS-региона позволил выявить аутапоморфные нуклеотидные замены в роде Spiraea, а также позволил обнаружить предполагаемые гибриды. Выявлено, что «чистые» образцы S. salicifolia из Якутии, Приморского, Хабаровского края, Амурской области и «чистые» экземпляры близкого ему S. humilis из Хабаровского края и Якутии отличаются по 6 однонуклеотидным заменам. Предполагается гибридная природа образцов S. salicifolia × S. humilis, обнаруженных в Тындинском районе Амурской области (граница на юге Якутии) и Усть-Майском районе юго-восточной части Якутии (табл. 2). Также вероятно, что в Якутии (центральная и юго-восточная части) в зоне симпатрии чистых видов встречаются интрогрессивные гибриды S. media × S. dahurica, что подтверждается морфологически и наличием у них 3 транзиций в зоне ITS (табл. 3).
Выводы
Таким образом, выявленная нами степень нуклеотидного полиморфизма ITS-региона демонстрирует приемлемую пригодность для идентификации видов и обнаружения межвидовых гибридов рода Spiraea и частичную – рода Salix. Анализ нуклеотидного полиморфизма ITS-региона ив выявил видоспецифические генетические различия у видов подрода Salix в виде однонуклеотидных замен – трансверсий. Предполагается, что низкий нуклеотидный полиморфизм ITS-региона у видов подродов Chamaetia и Vetrix, вероятно, указывает на их микроэволюционную незрелость. У видов Spiraea в ITS-регионе обнаружены видоспецифические однонуклеотидные замены, инсерции/делеции, однонуклеотидные делеции, имеющие таксономическое значение на уровне секций, циклов и рядов. В центральной и юго-восточной частях Якутии в зоне симпатрии «чистых» видов обнаружены интрогрессивные гибриды спирей S. salicifolia × S. humilis, S. media × S. dahurica, что подтверждается морфологически и наличием специфичных точечных мутаций в регионе ITS. Полученные ITS-сиквенсы ив и спирей частично депонированы в международном банке генетических данных NCBI (KU302249; KU321584-KU321585; KU321587-KU321591).
Исследования выполнены в рамках проектов НИР ИБПК СО РАН № 52.1.11 «Разнообразие растительного мира таёжной зоны Якутии: структура, динамика, сохранение», № 52.2.8 «Лесные экосистемы криолитозоны Якутии в условиях глобального изменения климата и антропогенного воздействия: состав, структура, продуктивность, прогноз динамики», а также при финансовой поддержке РФФИ (гранты №15-44-05103 и № 15-04-03093).