Scientific journal
International Journal of Applied and fundamental research
ISSN 1996-3955
ИФ РИНЦ = 0,564

MOLECULAR-GENETIC RESEARCHES ON SALIX L. AND SPIRAEA L. OF YAKUTIA ON THE BASIS OF SEQUENCING DATA OF ITS RDNA

Polyakova T.A. 1 Efimova A.P. 2 Shatokhina A.V. 1
1 Vavilov Institute of General Genetics of RAS
2 Institute of Biological Problems of Permafrost
In article results of molecular-genetic researches on the basis of a nucleotide sequencing of intergenic internal transcribed spacer (ITS-region) of nuclear rDNA for the purpose of identification of species and interspecific hybrids of Salix and Spiraea in Yakutia are given. The revealed degree of nucleotide polymorphism of the ITS region shows the acceptable suitability for species identification and detection of trans-species hybrids of the Spiraea genus and partial suitability – of the Salix genus. The analysis of nucleotide polymorphism of the ITS region of willows has revealed species-specific genetic distinctions at species of the subgenus Salix in the form of one-nucleotide replacements – transversions. It is supposed that low nucleotide polymorphism of the ITS region at species of the subgenus Chamaetia and Vetrix probably indicates their microevolutionary immaturity. The species-specific one-nucleotide replacements, insertions/deletions, one-nucleotide deletions having taxonomical value at the level of sections, cycles and ranks are found in species of the genus Spiraea in the ITS region. In the central and southeast parts of Yakutia in a simpatric zone of «pure» species introgressive hybrids of S. salicifolia ? S. humilis, S. media ? S. dahurica meet that is confirmed morphologically and existence of specific one-nucleotide replacements in ITS region.
Salix
Spiraea
ITS-region
rDNA
nucleotide sequencing
hybrid
Yakutia

Представители Salix L. (Salicaceae) и Spiraea L. (Rosaceae) известны как одни из наиболее полиморфных древесно-кустарниковых растений, широко распространенных в северном полушарии. Наблюдаемые явления межвидовой гибридизации усложняют и без того непростую систематику этих родов.

Цель исследования

Для видовой идентификации и выявления гибридных комбинаций ив и спирей, а также для понимания роли гибридизации в изменчивости и микроэволюции необходимы исследования на стыке ботаники и генетики. В связи с этим нами начаты молекулярно-генетические исследования с целью идентификации видов и межвидовых гибридов Salix и Spiraea.

Материал и методы исследования

Для выделения ДНК с 2-летних побегов ив и спирей собирались молодые неповрежденные листья и сушились в силикагеле. Лабораторные работы по выделению и анализу фрагментов ДНК выполнены в г. Москва в Институте общей генетики РАН им. Н.И. Вавилова. Геномная ДНК выделена с использованием модифицированного CTAB протокола. Для амплификации фрагмента ITS-оперона рибосомальной ДНК (рДНК) использовали праймеры ITS6 и ITS9, разработанные для восточноазиатских видов трибы Spiraea [9] и успешно протестированные нами [8]. Цикл амплификации включал: денатурацию при 94° С в течение 1 минуты, отжиг праймеров при 58° С в течение 50 секунд и элонгацию при 72° С в течение 1 минуты с числом циклов – 30. Полученные ПЦР-фрагменты были очищены набором реагентов для быстрой элюции ДНК из агарозных гелей Diatom DNA Elution. Секвенирование ITS фрагментов проводили в ЗАО «Евроген» в обоих направлениях. Сиквенсы были попарно выравнены в программе BioEdit, множественное выравнивание выполнено в программе ClustalW2 с визуальной проверкой спорных позиций на хроматограммах. Эволюционные исследования выполнены в программе MEGA 6 [10]. Для оценки таксономических различий видов и выявления гибридов выбран регион ITS, включающий межгенные спейсеры ITS1 и ITS2 и ген 5.8S ядерной рибосомальной ДНК. Ядерные последовательности ITS зарекомендовали себя как наиболее востребованные маркеры для видоидентификации и филогенетики растений [2, 4, 6] благодаря ряду преимуществ, среди которых высокая вариабельность, консервативная протяженность, высокая копийность, а также двуродительское наследование [1], обеспечивающее идентификацию недавно возникших гибридов [5]. Молекулярно-генетические исследования дальневосточных ив с применением ITS-региона рДНК впервые для России были проведены В.Ю. Баркаловым, М.М. Козыренко [7]. Результаты работ позволили частично прояснить взаимоотношения видов и секций в подроде Salix, а также выявить родственные связи Chosenia и Toisusu. Высокая схожесть пластидной и ядерной геномных характеристик большинства видов, принадлежащих роду Salix, включенных в анализ, может свидетельствовать о том факте, что они относительно недавно отошли от общего предка или это есть результат пересечения генеалогических линий через гибридизацию.

Нами исследования ив и спирей с использованием ITS-региона проведены впервые для Якутии. Образцы ив и спирей собраны в центральных (окрестности г. Якутска, среднее течение р. Лены), юго-восточных (бассейны рр. Мая, Юдома) и южных (р. Хани, окрестности г. Алдан, пос. Беркакит, Томмот) районах Якутии, а также взяты для анализа из гербарных фондовых материалов ИБПК СО РАН (SASY). Кроме того, образцы ив отобраны в северных (дельта и низовья р. Лены) и северо-восточных (Восточное Верхоянье, Колымская низменность) районах Якутии. Всего для исследования взято 165 образцов ив, составляющих 31 вид, и 25 предполагаемых межвидовых гибридов. Для сравнения также взяты образцы S. alba, S. fragilis, S. caprea из Московской области (окрестности г. Пущино и г. Звенигород), а также образцы S. lanata из Лапландии (гора Пикку-Малла). В данном исследовании проанализировано более 30 образцов спирей, составляющих 6 таксонов, а также включены в анализ дальневосточные и сибирские виды спиреи, изученные нами ранее [3].

Результаты исследования и их обсуждение

Анализ нуклеотидного полиморфизма ITS-региона рДНК рода Salix выявил генетические различия в виде однонуклеотидных замен – трансверсий (табл. 1) у 12 видов, в том числе аутапоморфных. Общая длина анализируемого фрагмента ITS составила 597 позиций, из них 24 вариабельны, 13 позиций филогенетически-информативны. Длина спейсера ITS1 составила 222-223 нуклеотида, ITS2 – 212 нуклеотидов, протяженность гена 5.8s – 163 нуклеотида. Последовательности изученных образцов разного происхождения, принадлежащих к одному виду, оказались идентичны.

Установлено, что методом секвенирования ITS-региона отчетливо идентифицируются виды более древнего подрода Salix, такие, как S. alba, S. fragilis, S. triandra, S. pseudopentandra. Они имеют определенный набор трансверсий, отделяющих их от других видов ив и от близких к ивам тополей. В условиях Якутии S. triandra, S. pseudopentandra внешне не полиморфны, практически не вступают в межвидовые скрещивания, и это может характеризовать их как устоявшиеся в процессе микроэволюции виды. Иная картина наблюдается у подродов Chamaetia и Vetrix – путем анализа нуклеотидного полиморфизма ITS большинство видов не идентифицируется. Удалось в некоторой степени верифицировать 7 видов и установить 2 гибрида: Salix udensis × viminalis и Salix × zhataica = S. brachypoda × S. pyrolifolia. В целом у этих подродов матрица сиквенсов обнаруживает некий парадокс: фенотипически весьма близкородственные односекционные виды имеют разделяющие их транзиции, в то время, как отдаленные разносекционные виды имеют идентичную нуклеотидную последовательность.

Таблица 1

Положение однонуклеотидных замен в спейсерах ITS 1 и ITS 2 рДНК у видов рода Salix

ITS 1

 

ITS 1

 

ITS 2

 

ITS 2

 

Позиция

Замена

Позиция

Замена

Позиция

Замена

Позиция

Замена

26

T→C

139

C→T

368

Т→С

540

T→C

34

C→T

158

T→G

453

C →A

546

C→T

77

T→C

165

T→C

469

A→T

575

T→C

81

A→T

171

A→C

526

C →T

581

T→A

Таблица 2

Мутации в области ITS у близких видов Spiraea salicifolia и S. humilis и их предполагаемых гибридов из Якутии

Позиция

Область

S. salicifolia

Предполагаемые гибриды

S. humilis

Орбогур

Лапри

39

ITS 1

T

T

C

C

92

ITS 1

T

C

T

C

106

ITS 1

T

T

T

C

615

ITS 2

C

C

C

T

627

ITS 2

T

T

T

C

629

ITS 2

C

C

C

A

Таблица 3

Транзиции в области ITS 1 и ITS 2 у видов Spiraea media и S. dahurica и их гибридов из Якутии

Позиция

S. media

Предполагаемые гибриды

S. dahurica

Буотама

Хани

Юдома

Ленские столбы

108

C

T

T

T

C

T

443

T

T

T

T

T

C

584

C

C

C

T

T

T

Для 30 образцов различных видов Spiraea, произрастающих в районах Центральной и Юго-Восточной Якутии, получены фрагменты, включавшие полноразмерный регион ITS 1-5.8s-ITS 2 и частично гены 18S и 26S. Были получены данные, сходные с нашими ранними исследованиями [3]. После выравнивания длина анализируемого фрагмента ITS насчитывала 660 позиций, из них 572 позиции консервативны, 85 вариабельны, но не информативны, 74 позиций оказались филогенетически-информативными. Сравнительное изучение ITS-фрагментов у изученных видов показало наличие как инделей, так и генных точечных мутаций – трансверсий и транзиций. По протяженности, а также по числу константных, вариабельных и филогенетически информативных сайтов спейсер ITS 1 более изменчив. Таксоноспецифичные инсерции/делеции наблюдались как в области ITS 1, так и ITS 2.

Тщательный анализ нуклеотидного полиморфизма ITS-региона позволил выявить аутапоморфные нуклеотидные замены в роде Spiraea, а также позволил обнаружить предполагаемые гибриды. Выявлено, что «чистые» образцы S. salicifolia из Якутии, Приморского, Хабаровского края, Амурской области и «чистые» экземпляры близкого ему S. humilis из Хабаровского края и Якутии отличаются по 6 однонуклеотидным заменам. Предполагается гибридная природа образцов S. salicifolia × S. humilis, обнаруженных в Тындинском районе Амурской области (граница на юге Якутии) и Усть-Майском районе юго-восточной части Якутии (табл. 2). Также вероятно, что в Якутии (центральная и юго-восточная части) в зоне симпатрии чистых видов встречаются интрогрессивные гибриды S. media × S. dahurica, что подтверждается морфологически и наличием у них 3 транзиций в зоне ITS (табл. 3).

Выводы

Таким образом, выявленная нами степень нуклеотидного полиморфизма ITS-региона демонстрирует приемлемую пригодность для идентификации видов и обнаружения межвидовых гибридов рода Spiraea и частичную – рода Salix. Анализ нуклеотидного полиморфизма ITS-региона ив выявил видоспецифические генетические различия у видов подрода Salix в виде однонуклеотидных замен – трансверсий. Предполагается, что низкий нуклеотидный полиморфизм ITS-региона у видов подродов Chamaetia и Vetrix, вероятно, указывает на их микроэволюционную незрелость. У видов Spiraea в ITS-регионе обнаружены видоспецифические однонуклеотидные замены, инсерции/делеции, однонуклеотидные делеции, имеющие таксономическое значение на уровне секций, циклов и рядов. В центральной и юго-восточной частях Якутии в зоне симпатрии «чистых» видов обнаружены интрогрессивные гибриды спирей S. salicifolia × S. humilis, S. media × S. dahurica, что подтверждается морфологически и наличием специфичных точечных мутаций в регионе ITS. Полученные ITS-сиквенсы ив и спирей частично депонированы в международном банке генетических данных NCBI (KU302249; KU321584-KU321585; KU321587-KU321591).

Исследования выполнены в рамках проектов НИР ИБПК СО РАН № 52.1.11 «Разнообразие растительного мира таёжной зоны Якутии: структура, динамика, сохранение», № 52.2.8 «Лесные экосистемы криолитозоны Якутии в условиях глобального изменения климата и антропогенного воздействия: состав, структура, продуктивность, прогноз динамики», а также при финансовой поддержке РФФИ (гранты №15-44-05103 и № 15-04-03093).