Результатами современных исследований установлено, что канцерогенез представляет собой многоступенчатый процесс генетических и эпигенетических нарушений, которые приводят к прогрессивной трансформации нормальных клеток в опухолевые. В то же время не вызывает сомнений и тот факт, что некоторые формы рака не только поддаются лечению в случае их ранней диагностики, но и могут быть профилактированы отказом от курения, эффективным лечением рекуррентных инфекций, защитой от интенсивной инсоляции, а также воздействия токсических веществ из окружающей среды. Важное место в профилактике онкологических заболеваний отводится и характеру питания. Широкомасштабными эпидемиологическими исследованиями выявлено, что диета, обогащенная продуктами растительного происхождения, которые содержат вещества с онкопревентивными свойствами (каротиноиды, катехины, полифенолы, изофлавоны, витамины, а также балластные вещества), доказала свою эффективность по показателям снижения риска развития, а также выживаемости и качества жизни при ряде опухолей – меланоме, раке молочной железы, простаты, матки, мочевого пузыря, толстого кишечника [2]. Известно также, что регулярное употребление овощей семейства крестоцветных, лука, зеленого чая, цитрусовых, соевых бобов, томатов, винограда, плодов клюквы, брусники, черники, малины, ассоциировано со снижением риска развития рака [8]. Вещества с онкопревентивными и онкотерапевтическими свойствами в высокой концентрации содержатся и в специях – куркуме, гвоздике, розмарине, эстрагоне, мускатном орехе, чесноке. Однако большинство из этих веществ характеризуется невысокой активностью, а также низкой биодоступностью из – за малой растворимости, высокого системного метаболизма, нестабильности во внешней среде, поэтому их требуется употреблять в высоких дозах, что в ряде случаев сопровождается формированием побочных реакций.
С целью повышения стабильности, биодоступности, снижения риска развития побочных эффектов лекарственных препаратов в настоящее время применяется технология создания препаратов типа «хозяин – гость», в которых в качестве «гостя» используется фармакологически активное вещество, а «хозяина» – высокомолекулярный носитель, например, арабиногалактан (АГ) [4]. АГ, помимо собственных иммуномодулирующих свойств, способен формировать комплексы с лекарственными веществами, увеличивая их стабильность, растворимость, и повышая таким образом их фармакологическую активность.
Учитывая эти данные, целью настоящего исследования было выявление противоопухолевой эффективности хлеба с добавлением механически модифицированного измельчением до размера наночастиц и иммобилизацией на полисахаридном носителе комплекса биологически активных компонентов специй (КС) на модели роста экспериментальной меланомы В16 у животных.
Материал и методы исследования
Исследование выполнено на 60 мышах-самцах (CBAхC57BL/6)F1, в возрасте трех месяцев, с массой тела 25 – 27 г, полученных из экспериментально-биологической клиники лабораторных животных СО РАМН (Новосибирск).
Эксперименты проводили в соответствии с правилами, принятыми Европейской конвенцией по защите животных, используемых для научных целей (Страсбург, 1986), с соблюдением принципов гуманности, изложенных в директивах Европейского сообщества (86/609/ЕЕС) и Хельсинкской декларации, а также в соответствии с «Правилами проведения работ с использованием экспериментальных животных» (Приказ Министерства Здравоохранения Российской Федерации от 19.06. 2003 № 267 «Правила лабораторной практики в РФ»). Животных содержали в условиях лабораторного вивария в клетках по 10 особей в каждой, при свободном доступе к воде и пище, естественном световом режиме. Мыши, включенные в исследование, случайным образом были разделены на 3 группы. В качестве экспериментальной опухолевой модели использовали рост перевиваемой линии мышиной меланомы В16, полученной из коллекции НИИ фундаментальной и клинической иммунологии, в мышечной ткани. Животным исследуемых групп внутримышечно, однократно, в верхнюю треть бедра инокулировали по 4 х 105 клеток меланомы в 0,2 мл физиологического раствора на одно животное. За 7 суток до инокуляции клеток опухоли в пищевой рацион животных опытной группы включали ржано – пшеничный хлеб, условно названный «Докторский пряный», изготовленный по традиционной технологии, с добавлением модифицированного КС (20 г/кг), из расчета 20 г. на 1 животное в сутки, а мышам контрольных групп – ржано – пшеничный хлеб с добавлением немодифицированного КС, или без такового в соответствующем количестве и в те же сроки. Кормление животных с добавлением хлеба продолжали в течение 21 суток после инокуляции клеток опухоли. Комплекс специй представлял собой смесь биологически активных веществ специй (БАВ) – куркумина, α-турмерона, аллицина, Z-аджоена, апигенина, эвгенола (Sigma Aldrich) в равных количествах, и арабиногалактана («Аметис», Благовещенск, Россия). Модификация КС до размера наночастиц осуществлялась в соответствии с методикой, описанной нами ранее [1], механохимической обработкой его в смеси с АГ, представляющим собой полисахарид природного происхождения, получаемый из древесины лиственницы даурской и состоящий из звеньев галактозы и арабинозы с высокой степенью ветвления, в шаровой ротационной мельнице (энергонапряженность 1g) в массовых соотношениях БАВ/АГ - 30:1 в течение 2 часов, с целью формирования механокомпозитов. Рентгенофазовый анализ порошкообразных композиций КС проводился на дифрактометре ДРОН-3 (Россия). Электронные микрофотографии композиций БАВ/АГ получали на электронных микроскопах JEOL и HITACHI ТМ-1000 (Япония). Гранулометрический состав водных суспензий композиций КС исследовали на лазерном гранулометре Micro-Sizer 201 (Россия).
По окончании эксперимента оценивали выживаемость животных, а также суммарную массу очагов опухоли в тканях. Масса очагов опухоли определялась как разница массы бедра с опухолью и здорового оппозитного бедра животного после удаления шкуры. Выживаемость животных учитывали путем ежедневного учёта их количества в опытной и контрольной группе.
Статистическую обработку результатов исследования проводили с использованием непараметрического U-критерия Манна - Уитни для двух независимых групп, с использованием коммерческого пакета программ “Statistica 7.0” (StatSoft, USA). Результаты представляли в виде медианы и интервала между 1 и 4 квартилями (Ме (25%; 75%). Различия считали статистически значимыми при р < 0,05.
Результаты исследования и их обсуждение
Структурная характеристика композиции. Материал КС, на основании электронных микрофотографий, состоял из округлых наночастиц размером 20-100 нм, агрегированных в рыхлые агрегаты размером 5 мкм. Около 30% материала составляли агрегаты размером менее 5 мкм. Следовательно, механохимическая обработка КС позволяет увеличить количество малоразмерных (менее 5 мкм) фракций частиц КС, соответственно, и количество биологически активных веществ, сорбированных наиболее биологически активными микро- и наноразмерными частицами арабиногалактана.
Терапевтическая эффективность композиции. У всех животных, включенных в эксперимент, после инокуляции клеток опухолевой линии был обнаружен рост очагов опухоли в мышечной ткани. Учет продолжительности жизни мышей - опухоленосителей выявил, что мыши опытной и контрольных групп не отличались по показателю выживаемости в указанные сроки наблюдения. В то же время оценка роста очагов опухоли в мышцах показала, что в группе мышей, получавших в составе пищевого рациона хлеб с добавлением наноструктурированного КС, наблюдалось уменьшение их роста по сравнению как с контрольной группой, получавшей хлеб с немодифицированным КС, так и без него. Показатели роста очагов опухоли в контрольных группах не отличались между собой. Уменьшение роста опухоли выражалось в более низких показателях абсолютной суммарной массы ее очагов, по сравнению с таковой животных контрольных групп. Полученные данные представлены в Таблице 1.
Таблица 1.
Показатели роста очагов опухоли у мышей при воздействии хлеба с добавлением биологически активных веществ комплекса специй (Ме (25%; 75%)
|
Группы животных |
Суммарная масса очагов опухоли, г. |
|
Контроль I |
5,62 (4,9; 6,5) |
|
Контроль II |
5,81 (5,0; 6,3) |
|
Опыт |
4,4 (3,2; 5,0)* |
Примечание: n = 15 в каждой группе. * p<0,05 между группами животных. Контроль I – хлеб без добавления КС; контроль II – хлеб с немодифицированным КС; опыт - хлеб с модифицированным КС;
Таким образом, полученные данные об уменьшении количества очагов меланомы В16 в мышечной ткани у экспериментальных животных свидетельствуют о том, что хлеб с добавлением механохимически модифицированного КС обладает противоопухолевыми свойствами.
Известно, что вещества с онкопревентивными и онкотерапевтическими свойствами, которые содержатся в специях – куркуме, гвоздике, розмарине, эстрагоне, мускатном орехе, чесноке, характеризуются низкой биодоступностью при поступлении их в систему пищеварения из-за высокого системного метаболизма, незначительной абсорбции, низкой растворимости в воде и частичной инактивации в кислой среде желудка [6], что значительно ограничивает их клиническую эффективность, что и было подтверждено отсутствием противоопухолевого эффекта у мышей, которых кормили хлебом с добавлением немодифицированного КС. Мы использовали метод механического измельчения БАВ в высокоинтенсивных шаровых мельницах до размера наночастиц с иммобилизацией на полисахаридном носителе, как было описано выше, с целью получения наноразмерных фракций КС и формирования более стабильного механокомпозита для повышения его биодоступности - увеличения растворимости и устойчивости во внешней среде. Хлеб, как продукт, занимающий важное место в структуре питания практически всех слоев населения, широкодоступный, употребляющийся регулярно, на протяжении всей жизни индивида, был выбран для исследования и придания ему потенциальных противоопухолевых свойств.
В составе специй, использованных в эксперименте, согласно данным современных исследований, идентифицированы вещества, обладающие противораковыми свойствами. Так, куркума, получаемая из корневищ растения порядка имбирных Curcuma Longa L., произрастающей преимущественно в Индии и Юго – Восточной Азии, рассматривается как одна из наиболее активных антиканцерогенных пряностей, благодаря высокому содержанию полифенолов семейства куркуминоидов, в частности, куркумина, а также турмерона. Противоопухолевая активность куркумина и турмерона подтверждена множеством исследований. В частности, у куркумы идентифицированы антипролиферативные, антиангиогенные, антиметастатические свойства, а также способность повышать уровень апоптоза раковых клеток [9]. У турмерона, который преобладает в эфирном масле корневищ Curcuma purpurascens Bl., произрастающей в Индонезии, выявлена высокая цитотоксическая активность в отношении клеток опухолевой линии колоректального рака человека HT29 [7].
Наиболее биологически активными компонентами чеснока являются аллицин (diallyl thiosulfinate), обладающий, наряду с онкопротекторными, также кардиопротекторыми и гиполипидемическими свойствами [11], и аджоен (4,5,9-trithiadodeca-1,6,11-triene 9-oxide), вещество, молекула которого содержит серу в высокой концентрации, обладающее широким спектром биологической активности, включающем антибактериальные (Escherichia coli, Klebsiella pneumoniae, Xanthomonas maltophilia), а также цитотоксические свойства в отношении раковых клеток. Например, Z-аджоен подавлял рост популяции стволовых опухолевых клеток GBM CSC (Glioblastoma Multiforme Cancer Stem Cell), не затрагивая при этом нетрансформированные клетки [5].
Апигенин, флавон растительного происхождения, присутствующий во множестве овощей, фруктов и пряно – вкусовых растений – петрушке, сельдерее, орегано, тимьяне, рассматривается как эффективное онкопревентивныое вещество, так как обладает противовоспалительными, антиоксидантными и противораковыми свойствами [10].
Эвгенол, представляющий собой фенилпропаноид, содержащийся в эфирных маслах целого ряда растений, например, Artemisia dracunculus (эстрагон), Syzygium aromaticum (гвоздика),Daucus carota(морковь),Myrstica fragrans(мускатный орех) иRosmarinus officinalis(розмарин), также обладает онкопротекторными свойствами. Например, выявлена противораковая активность эвгенола в отношении клеток опухолевой линии рака шейки матки HeLa, которая обеспечивается за счет индукции апоптоза, остановки клеточного цикла и потере мембранного потенциала клетки. Кроме того, эвгенол в комбинации с цисплатином и мирицетином усиливал действие данных цитостатиков, увеличивая степень апоптоза клеток опухоли за счет более выраженной активации каспазы 3 [12].
Арабиногалактан, который был использован в качестве носителя БАВ и представляющий собой нетоксичный биосовместимый высокомолекулярный разветвленный полисахарид, содержащий β – галактозу, употребляется человеком в пищу на протяжении многих веков, так как содержится во множестве овощей – редисе, моркови, кукурузе, томатах, пшенице. В качестве промышленного источника АГ используется древесина различных видов лиственницы (Larix sibirica, Larix gmelinii) . АГ присущи иммуномодулирующие свойства – стимуляция пролиферации спленоцитов, активности естественных киллеров, макрофагов, Т и В лимфоцитов, секреции провоспалительных цитокинов. АГ в комплексе с флавоноидами, при применении его per os у экспериментальных животных, приводил к активации клеток иммунной системы, увеличению цитотоксической активности сыворотки крови [3]. Учитывая, что АГ способен формировать комплексы с лекарственными веществами, увеличивая их стабильность, растворимость, и повышая их фармакологическую активность, а также его иммуномодулирующие свойства, данный полисахарид был выбран в качестве носителя БАВ с противораковыми свойствами.
Примененная нами механохимическая технология получения композиции БАВ/АГ позволила измененить фазовое состояние композициии - многократно увеличить долю наиболее мелких биологически активных частиц в механокомпозите, что и является предполагаемым механизмом повышения противоопухолевой активности механохимически модифицированного КС.
Полученные нами в данном исследовании данные свидетельствуют, что механохимически модифицированный КС в составе хлеба продемонстрировал противоопухолевую активность в отношении роста экспериментальной меланомы В16, которая выражалась в уменьшении количества очагов опухоли в конечности животного, в которую инокулировали клетки опухоли, по сравнению с контрольной. Следовательно, модифицированный КС в составе хлеба обладал достаточной стабильностью во внешней среде и биодоступностью для реализации его противоопухолевых свойств. Мы предполагаем, что возможными механизмами сохранения противоопухолевых свойств КС является механохимическая модификация, которая увеличивает и растворимость БАВ, и их термостабильность, а также устойчивость к изменению кислотности среды [4]. Выявление конкретных механизмов сохранения противоопухолевых свойств КС в составе хлеба требует дальнейшего углубленного изучения, так как хлеб с добавлением механохимически модифицированного КС перспективен как потенциальный продукт функционального питания для профилактики и адьювантной терапии онкологических заболеваний.
Выводы
В результате проведенных экспериментов была установлена противоопухолевая эффективность хлеба, обогащенного измельченным до размера наночастиц и иммобилизованном на полисахаридном носителе комплексом биологически активных веществ специй в отношении роста экспериментальной меланомы В16 у животных – опухоленосителей.