Scientific journal

International Journal of Applied and fundamental research

ISSN 1996-3955

ИФ РИНЦ = 0,593

Неуклонное увеличение использования водных ресурсов сопровождается возрастающим влиянием антропогенных факторов на режим водоемов и водные экосистемы. Прогнозы интенсивности водопотребления показывают, что антропогенный пресс на гидроэкосистемы будет продолжаться и в отдаленной перспективе может привести к непредвиденным последствиям. Биологическая очистка городских и промышленных сточных вод практически во всех странах мира на 90% производится в аэротенках. Городские станции аэрации и сооружения биологической очистки сточных вод промышленных производств в середине прошлого столетия были единственной преградой глобального загрязнения внешних и внутренних водоемов. Однако уже через 20 – 30 лет интенсивной эксплуатации аэротенков возникли серьезные проблемы, касающиеся утилизации избыточного активного ила. Огромные площади земли изъяты из оборота в связи с шламированием отработанного активного ила, который зачастую содержит недоокисленные адсорбированные соединения органического и неорганического характера с различной степенью токсичности. Проблема усугубляется проникновением недоокисленных соединений в верхние горизонты подземных вод и угрозой попадания в скважинные воды.

В настоящее время в лабораторных, опытно-промышленных и промышленных испытаниях показана возможность и перспективность биологической очистки городских и промышленных сточных вод иммобилизованным на синтетических волокнах ценозом в анаэробно-аэробных условиях [3–5]. Разработанные методы внедряются в различных регионах России. Перспективность метода заключается в том, что снимается основная проблема биологической очистки в аэротенках – отсутствие избыточного активного ила и исключение шламирования илов. Иммобилизованный на синтетических волокнах микроценоз в итоге представляет собой смешанную популяцию бактерий, простейших, грибов, коловраток и водорослей, образующих пищевую цепь. В ценозе образуется несколько трофических уровней: первый представлен гетеротрофными бактериями, высокая окислительная способность которых обуславливает их ведущую роль в биодеградации загрязнителей; на втором уровне находятся жгутиконосцы, ресничные инфузории и коловратки; третий уровень представлен сосущими инфузориями. Количество организмов каждого трофического уровня зависит от таких факторов, как состав поступающей сточной воды, температуры, рН, концентрации кислорода и др. В зависимости от технологических параметров образуется замкнутая модельная гидроэкосистема – биореактор.

Опыт эксплуатации биореакторов показал, что эффективность их работы зависит от многочисленных факторов, из которых следует выделить кислородный режим. Большинство разработанных методов биологической очистки сточных вод иммобилизованным ценозом на синтетических носителях предполагает анаэробно-аэробные условия с преобладанием анаэробных процессов окисления загрязнителей. Иммобилизация клеток-деструкторов загрязнителей на носителях – несомненно, новое, перспективное и сложное направление в биотехнологии. Конструирование таких биоценозов требует специалистов высокой квалификации, владеющих фундаментальными знаниями микробиологии, гидробиологии, биохимии и других смежных дисциплин.

Применяемые в настоящее время традиционные методы определения и контроля функционального состояния модельных и природных гидроэкосистем не дают исчерпывающей информации о молекулярных и субмолекулярных механизмах стабилизации последних. В связи с этим особое значение приобретают исследования, направленные на изучение состава молекулярных форм ключевых ферментов метаболизма микроценозов гидроэкосистем, их роли в реанимации при техногенных, особенно экстремальных воздействиях на водные экосистемы.

Для организации непрерывного биомониторинга природных и модельных гидроэкосистем, в частности, процессов биологической очистки воды в биореакторах, требуются надежные, информативные способы оценки функционального состояния иммобилизованных микроценозов, характеризующие процессы метаболизма и окислительную мощность биореакторов в целом. Одним из таких ферментов является глутаматдегидрогеназа (ГДГ).

Глутаматдегидрогеназа (L-глутамат: NAD-оксидоредуктаза дезаминирующая, 1.4.1.2., ГДГ ) катализирует обратимое превращение L-глутамата в 2–оксоглутарат:

L-глутамат + Н2О + NAD ↔ ↔ 2–оксоглутарат + NH3+ NADH.

ГДГ является ведущим дезаминирующим ферментом метаболизма белков и аминокислот. Аминогруппы последних переносятся на 2–оксоглутаровую кислоту с образованием глутамата. Под действием ГДГ глутамат вновь превращается в 2–оксоглутаровую кислоту. Обратимость реакции имеет фундаментальное значение в синтезе аминокислот, обмене белков и углеводов, включении промежуточных продуктов метаболизма в цикл трикарбоновых кислот. Ключевое положение ГДГ в процессах метаболизма определяет важность исследования состава, степени гетерогенности и динамики активности ее молекулярных форм (МФ) в ценозах модельных и природных гидроэкосистем, тем более что биосинтетические пути глутамата предположительно одинаковы для всех живых систем, в том числе и для микробных сообществ гидроэкосистем.

Цель работы. Определить состав молекулярных форм, общую и относительную активность L-глутаматдегидрогеназы иммобилизованного микроценоза биореакторов.

Материалы и методы исследования

Исследования проводили на действующих сооружениях биологической очистки сточных вод НПЗ, работающих в проточном режиме без аэрации на первой ступени и с микроаэрацией на второй ступени очистки.

Пробы иммобилизованной биомассы отбирали на входе, в центре и выходе из первой ступени, в центре второй ступени, а также в отстойниках после первой и второй ступеней очистки.

Ферментные образцы получали следующим способом: 1,0–1,5 г сырой биомассы трехкратно отмывали 0,1 М фосфатным буфером с рН 7,0 от фоновых загрязнений, центрифугировали при 5000 об/мин 10 мин. Осадок дезинтегрировали в механическом дезинтеграторе в течение 5 мин при 4°С. Затем переносили его в колбу, добавляли 5 мл фосфатного буфера и тритона Х-100 в конечной концентрации 20 мг/мл. Колбу помещали на магнитную мешалку для солюбилизации фермента на 2 ч при 37°С. Гомогенат центрифугировали при 8000 об/мин 10 мин. В супернатанте определяли МФ ГДГ методом электрофореза в плоских блоках полиакриламидного геля. В работе использовали реактивы и материалы для диск-электрофореза («Reanal», Венгрия).

Анализируемые образцы в объеме 50 мкл в смеси с 40% раствором сахарозы наносили на линию старта. В качестве электродного буфера использовали 1 М трис-ЭДТА-боратный буфер с рН 9,2. Электрофорез проводили при величине тока 5,0 мА/см первые 30 мин, а затем 10,0 мА/см до окончания электрофореза. МФ ГДГ выявляли феназинметасульфат-тетразолиевой реакцией в среде следующего состава: водные растворы НАД (1 мг/мл) – 40 мл, нитросинего тетразолиевого (1 мг/мл) – 30 мл, L-глутамата натрия 1 М раствора с рН 7,0 – 5 мл, феназинметасульфата (1 мг/мл) – 2 мл, 0,1 М фосфатного буфера с рН 7,0 – до 100 мл. Инкубировали 3 ч при 37°С. МФ ГДГ выявлялись в виде темно-синих зон [1].

Относительную активность МФ фермента устанавливали путем прямой денситометрии на анализаторе фореграмм АФ-1 (ПО «Львовприбор», Украина). Количество белка в образцах определяли биуретовой реакцией.

Результаты исследования и их обсуждение

ГДГ иммобилизованного микроценоза в процессе биологической очистки сточных вод НПЗ в анаэробно-аэробных условиях представлена пятью МФ: основной – ГДГ-5 и минорными, незначительно отличающимися по электрофоретической подвижности, представляющими, по-видимому, конформационные изомеры фермента (рис. 1).

Рис. 1. Спектры МФ ГДГ первой ступени на входе в биореактор (а), в центре (б), на выходе (в), во вторичном отстойнике (г), в центре второй ступени (д), во вторичном отстойнике второй ступени (е): А – концентрирующий гель; В – разделяющий гель; 1–5 – зоны активности ГДГ

На входе в первую ступень в относительно анаэробных условиях основная активность фермента локализована в области ГДГ-5.

В центре биореактора и на выходе из него в условиях микроаэрации отмечали значительную инактивацию ГДГ-1 и ГДГ-5 при одновременном росте активности ГДГ-2 и ГДГ-3. На второй ступени очистки наблюдали продолжение роста активности ГДГ-2 и ГДГ-3 и активацию ГДГ-4. Активность ГДГ-1 ниже таковой входа в первую ступень, а активность ГДГ-5 снижается до минимума. Заслуживает внимания резкая перестройка в соотношении активности МФ ГДГ в отстойниках: двух-пятикратная активация ГДГ- 5 и снижение активности МФ ГДГ-1, ГДГ-2 и ГДГ-3 (табл. 1).

Таблица 1

Динамика относительной активности МФ ГДГ иммобилизованного ценоза

Это может быть объяснено изъятием загрязнителей, их окислением и улавливанием энергии в форме аденилатов, которые в свою очередь являются отрицательными эффекторами реакции окислительного дезаминирования глутамата.

Установлена следующая динамика общей активности ГДГ в процессе очистки сточных вод иммобилизованным микроценозом: максимальная на входе в первую ступень, постепенное снижение к выходу из биореактора и достижение активности входа во вторичном отстойнике. На второй ступени в центре биореактора активность ГДГ становится на уровне таковой выхода из первой ступени, отмечена активация фермента во вторичном отстойнике.

Анализ динамики изменений в соотношениях активности МФ ГДГ позволяет предположить, что ГДГ-4 и ГДГ-5 проявляют максимальную активность в относительно анаэробных условиях. Этот факт заслуживает внимания, поскольку именно в этих областях концентрируется основная масса фермента, более низкомолекулярные формы активны в анаэробно-аэробных условиях.

Показатели работы биореактора и динамика активности МФ ГДГ свидетельствуют о неблагоприятном функциональном состоянии иммобилизованного микроценоза, преобладании анаэробных процессов над аэробными и снижении эффективности очистки сточных вод. После коррекции технологии, предполагающей увеличение концентрации кислорода в воде на выходе из первой ступени очистки и во всем объеме второй ступени очистки, получены следующие результаты. Число МФ ГДГ осталось равным пяти, причем, на фоне незначительного снижения общей активности фермента к выходу из первой ступени очистки установлены следующие изменения в соотношении активности МФ в разных точках биореактора: активация ГДГ-1 от входа к центру и незначительное снижение таковой к выходу из биореактора, активация ГДГ-2 и ГДГ-3 и снижение активности ГДГ-4 и ГДГ-5. В центре второй ступени отмечено увеличение активности ГДГ-2 и ГДГ-3 и снижение таковой у ГДГ-5. В отстойниках основная активность сконцентрирована в области ГДГ-4 и ГДГ-5. Показатели работы биореактора до и после коррекции технологии очистки представлены в табл. 2 и 3.

Таблица 2

Показатели работы биореактора до и после коррекции технологии очистки

Таблица 3

Динамика относительной активности МФ ГДГ после коррекции технологии очистки

В водной среде биореактора первой ступени выявлены три зоны с выраженной ГДГ активностью, причем они отличаются от эндоферментов большей электрофоретической подвижностью (рис. 2).

Рис. 2. Спектры МФ ГДГ иммобилизованного микроценоза (а), в водной среде биореактора на входе (б), в центре (в), на выходе из биореактора (г): А – концентрирующий гель; В – разделяющий гель. 1–5 – зоны активности ГДГ

Установленное доказывает индукцию синтеза и транспорта в водную среду модифицированных форм фермента – субунимеров – трипептидов или дипептидов с сохраненной каталитической активностью [2]. Синтез и транслокация относительно низкомолекулярных форм ГДГ могут быть обоснованы накоплением в водной среде аммонийного азота.

Выводы

1. Установлена гетерогенная структура ГДГ в микроценозах биореакторов, включающая основную (ГДГ-5) и минорные формы фермента. Увеличения гетерогенности ГДГ в процессе развития экосистем не выявлено.

2. Структурная организация и динамика активности МФ фермента в процессе биологической очистки сточных вод НПЗ в биореакторах свидетельствуют о существовании тонких механизмов регуляции аминокислотного и белкового обменов в клетках и в водной среде на уровне субстратов, энергетического статуса и содержания кислорода в воде.

3. Установлено явное предпочтение реакции окислительного дезаминирования глутамата во вторичных отстойниках и в головных отсеках биореакторов. Переход сточных вод в аэрируемые участки сопровождается изменением соотношения активности МФ ГДГ в пользу восстановительного аминирования 2–оксоглутарата. Предпочтение реакции окислительного дезаминирования глутамата при относительном анаэробиозе подтверждено в сериях модельных экспериментов в условиях, лимитированных содержанием кислорода.

4. Данные о составе и соотношении активности МФ ГДГ иммобилизованных микроценозов могут быть использованы для организации контроля очистки сточных вод в биореакторах.