Гепатоцеллюлярная карцинома (ГЦК) входит в группу наиболее распространенных злокачественных опухолей с высокими показателями летальности. Самые высокие показатели заболеваемости отмечаются в странах Азии и Африки. В России на конец 2015 года на учете находилось 7360 пациентов, страдающих ГЦК, при этом летальность составила 43,6 % [1]. Единственным методом, позволяющим сделать объективное заключение, определяющее тактику лечения и прогноз заболевания, является гистологическое изучение биопсийного или операционного материала. Существенную, а в ряде случаев и ведущую, роль в диагностике и дифференциальной диагностике играют иммуногистохимические методы исследования [2].
Цель работы: анализ возможностей применения иммуногистохимических маркеров для диагностики и дифференциальной диагностики гепатоцеллюлярной карциномы.
Одним из первых маркеров, внедренных в практику иммуногистохимического ис-следования препаратов ткани печени, был альфа-фетопротеин. Последний представляет собой гликопротеин, который образуется в тканях (преимущественно в печени, кишечнике и желточном мешке) при развитии эмбриона и плода. В этой связи в нормальной ткани печени взрослого человека альфа-фетопротеин не определяется. Наряду с этим альфа-фетопротеин является достаточно специфичным маркером гепатоцеллюлярной карциномы (ГЦК). По данным литературы [16], положительная цитоплазматическая иммуногистохимическая реакция с альфа-фетопротеином отмечается в 25–40 % наблюдений ГЦК, имея нередко при этом очаговый характер. То есть данный иммуногистохимический маркер характеризуется относительно низкой чувствительностью, особенно при низкодифференцированных формах ГЦР. Вместе с тем, определение уровня альфа-фетопротеина в сыворотке крови считается эффективным методом для диагностики и контроля эффективности лечения ГЦК.
Большинство опухолевых клеток, представляющих аденокарциномы, характеризуются диффузной цитоплазматической реакцией с поликлональным раково-эмбриональным антигеном (пРЭА). Поскольку в состав пРЭА наряду с белками входит и билиарный гликопротеин, то иммуногистохимическая картина пРЭА в ткани ГЦК носит специфический характер в виде так называемой мелкой проволочной сетки курятника («chicken-wire fence»). Такая типичная картина канальцев отмечается в 60–90 % наблюдений высоко- и умереннодифференцированных ГЦК и в 25–50 % – низкодифференцированных форм [16, 21]. К сожалению, примерно в половине анализируемых препаратов наблюдается и цитоплазматическое окрашивание опухолевых клеток, что затрудняет проведение дифференциальной диагностики с метастатическими аденокарциномами. При этом моноклональный РЭА в ткани ГЦК не выявляется.
Для подтверждения эпителиальной природы новообразования используются различные цитокератины (ЦК). При этом нормальные и опухолевые гепатоциты характеризуются положительной реакцией на ЦK 8 и 18, в то время как реакция на ЦК 7, 19 и 20 – отрицательная [16, 19]. В этой связи реакция на цитокератины используется для дифференциальной диагностики ГЦГ как от метастазов, так и предопухолевых гепатоцеллюлярных поражений [9]. Действительно, в качестве дифференциально-диагностического признака диспластических узелков высокой степени и ранней ГЦК на фоне цирроза печени используется оценка стромальной инвазии, характерная для ГЦК. В качестве уточняющего метода рекомендуется иммуногистохимическое выявление ЦК 7 и 19: наличие положительной реакции в протоках свидетельствует о псевдоинвазии и не требует верификации ГЦК [10].
Высокочувствительным и высокоспецифичным маркером печеночно-клеточной дифференцировки является антитело HepPar-1, реагирующее с ферментом цикла мочевины карбамил фосфат-синтазой митохондрий печени. В этой связи на иммуногистохимических препаратах положительная реакция проявляется в виде зерен в цитоплазме нормальных и опухолевых гепатоцитов. К сожалению, HepPar-1 не является патогномоничным показателем гепатоцитов, поскольку он также реагирует с митохондриями эпителия канальцев почек и кишечного эпителия. Тем не менее, HepPar-1 признан наиболее адекватным маркером ГЦК печени, так как его экспрессия определяется у 80–90 % больных. При этом интенсивность окрашивания ослабевает по мере снижения степени дифференцировки карциномы, а в ткани низкодифференцированной и скиррозной ГЦК может даже не определяться [16]. Кроме того, положительная очаговая реакция HepPar-1 может наблюдаться при карциноме легкого, пищевода, желудка, толстой кишки, желчного пузыря, шейки матки, надпочечника, а также в ткани меланомы и параганглиомы [17],
Другим маркером печеночно-клеточной дифференцировки является аргиназа (ARG1), катализирующая расщепление аргинина на орнитин и мочевину. Иммуногистохимическими методами определяется в ядре и цитоплазме клеток. По мнению B.C. Yan с соавт. [24], ARG1 обладает большей чувствительностью и специфичностью по сравнению с HepPar-1, особенно при анализе низкодифференцированной ГЦК. Однако имеются указания, что ARG1 может также выявляться в клетках протоковой аденокарциномы поджелудочной железы.
В последнее время для дифференциальной диагностики ГЦК все чаще стали использовать глипикан-3 (GPC3), представителя семейства гепаран-сульфат протеогликанов, сцепленных с клеточной поверхностью при помощи фосфатидилинозитолового якоря. Глипикан-3 определяется в плаценте и печени плода, участвуя в регуляции процессов пролиферации, дифференцировки и апоптоза клеток. В нормальных гепатоцитах печени взрослого человека не определяется. В то же время в ткани ГЦК глипикан-3 выявляется преимущественно в виде цитоплазматического и иногда мембранного или канальцевого окрашивания: в 69 % наблюдений высоко дифференцированных и в 81 % – умеренно дифференцированных форм [13]. Важным моментом является то, что глипикан-3 характеризуется большей чувствительностью по сравнению с HepPar-1 в ткани низкодифференцированной ГЦК [16]. По данным D. Baumhoer с соавт. [11], положительная экспрессия глипикана-3 наблюдается и в отдельных диспластических узелках высокой степени, что свидетельствует об их предопухолевой природе. Наряду с этим, реакция на глипикан-3 отсутствует в ткани гепатоцеллюлярной аденомы, очаговой узловой гиперплазии и при циррозе печени. К отрицательным моментам следует отнести отдельные случаи отрицательной реакции в наблюдениях высоко дифференцированной ГЦК и, наоборот, положительной реакции в ткани меланомы, карциномы желудка, плоскоклеточной карциномы легкого и герминогенных опухолей (хориокарциномы и опухолей желточного мешка) [16].
Еще одним маркером ГЦК является так называемый белок теплового шока 70 (HSP70), входящий в семейство белков теплового шока и имеющий молекулярную массу 70 кДа. Данные белки действуют как внутриклеточные шапероны, а также обладают выраженным антиапоптотическим эффектом [15]. При иммуногистохимическом исследовании HSP70 характеризуется ядерной и цитоплазматической реакцией и отмечается в 78 % наблюдений высоко дифференцированной и в 67 % – умеренно и низкодифференцированной ГЦК. Кроме того, он обнаруживался в 5 % диспластических узелков высокой степени и отсутствовал в диспластических узелках низкой степени [13]. E. Shin с соавт. [23] показали высокую корреляцию выраженной экспрессией HSP70 с размерами ГЦК, степенью гистологической дифференцировки и наличием сосудистой инвазии. Примечательно, что положительная реакция с HSP70 наблюдается и в эпителии желчных протоков, что рекомендуется использовать в качестве внутреннего контроля постановки реакций [13].
Основной функцией глутаминсинтетазы считается участие в детоксикации аммиака. В то же время ген глутаминсинтетазы активируется в результате ядерной транслокации бета-катенина. Видимо, именно поэтому в клетках бета-катенин-активированной гепатоцеллюлярной аденомы отмечается диффузная реакция глутаминсинтетазы. И это, видимо, также является основным фактором повышенного риска злокачественной трансформации данного типа гепатоцеллюлярных аденом. В нормальной же ткани печени положительная реакция глутаминсинтетазы наблюдается лишь в первом и втором слое гепатоцитов, окружающих терминальную печеночную венулу [12]. Развитие и прогрессирование ГЦК сопровождается увеличением частоты иммуногистохимического выявления глутаминсинтетазы в виде диффузной цитоплазматической окраски. Так, глутаминсинтетаза определяется в 14 % диспластических узелков высокой степени, в 59 % наблюдений высоко дифференцированной и в 86 % умеренно дифференцированной ГЦК [13].
Особую роль среди иммуногистохимических показателей ГЦК занимают маркеры кровеносных сосудов, поскольку наряду с диагностическими возможностями они могут использоваться и в качестве факторов прогноза. Действительно, многошаговый гепатоканцерогенез от предракового поражения до инвазивной формы опухоли сопровождается изменениями, как в структуре сосудов, так и ее кровоснабжении [6]. Так, по данным иммуногистохимического исследования эндотелиоциты нормальных синусоидов и при циррозе печени характеризуются отрицательной реакцией с антителами CD31 и CD34, в то время как эндотелиальные клетки сосудов в ткани диспластических узелков и ГЦК имеют положительную экспрессию данных маркеров. То есть реакцию с CD34 не рекомендуется использовать для дифференциальной диагностики диспластических узелков и ранней ГЦК.
Прогрессирующие процессы капилляризации синусоидов взаимосвязаны и со степенью злокачественности новообразования. В участках высокодифференцированной ГЦК встречаются как обычные синусоиды, так и микрососуды капиллярного типа, а при низкодифференцированной форме – только капилляры [7]. При этом синусоиды в высокодифференцированной ГЦК характеризуются неполной капилляризацией: положительные реакции на CD34 и ламинин являются слабыми и только местами. В процессе дедифференцировки отмечается увеличение площади участков с CD34-положительной реакцией и развитие признаков полной капилляризации, как это отмечается в умеренно-дифференцированном ГЦК. Согласно проведенным нами исследованиям [8], морфологические показатели васкуляризации ткани ГЦК зависят от размера узлов и степени гистологической дифференцировки. Максимальные значения количества и суммарной площади сечения CD34 положительных сосудов установлены в новообразованиях диаметром не более 5 см, а наименьшие – в опухолях размером более 10 см. Наибольшие значения показателя васкуляризации выявлены в ткани высоко дифференцированной ГЦК, а наименьшие – в наблюдениях низкодифференцированных карцином.
Следует также добавить, что изменения неоангиогенеза отражаются и на лучевых характеристиках образований: диспластические узелки обычно выглядят как изо- или гиповаскулярные участки, ГЦК же имеет характеристики гиперваскулярности в артериальную фазу исследования [14]. При этом лучевые характеристики выраженной ГЦК зависят также от размеров опухолевого узла [5] и степени гистологической дифференцировки [3, 4].
Важным моментом морфологического изучения ткани опухоли является оценка степени пролиферации ее клеток. К основным иммуногистохимическим маркерам, используемым для определения индексов пролиферации, относятся PCNA (ядерный антиген пролиферирующих клеток) и Ki-67, которые определяются в ядрах пролиферирующих клеток. При этом Ki-67 не экспрессируется в фазу G0. При иммуногистохимическом анализе PCNA положительных клеток было показано прогрессирующее увеличение их количества в ряду, отражающим этапы гепатоканцерогенеза: регенеративные узелки (2,6 ± 1,35), диспластические узелки низкой степени (15,3 ± 10,5), диспластические узелки высокой степени (25,4 ± 5,25), маленькая ГЦК (34,9 ± 15,7) [22]. Дальнейшее прогрессирование ГЦК (стадия I – IV) тоже сопровождается с увеличением количества Ki-67 положительных клеток [20]. При этом на основании проведенного мета-анализа Y. Luo с соавт. [18] установили, что более высокие значения индекса пролиферации клеток (по Ki-67) сочетаются не только с более высокой степенью злокачественности, но и с бoльшими размерами и количеством узлов, наличием сосудистой инвазии и метастазов.
Характеризуя иммуногистохимические маркеры, применяемые для верификации ГЦК, необходимо добавить, что эффективность такой диагностики повышается при использовании несколько антител. Как мы уже указывали, чувствительность и специфичность глутаминсинтетазы при диагностике высоко дифференцированной ГЦК составляет 59 % и 86 % соответственно, глипикана-3 – 69 % и 91 %, белка теплового шока 70–78 % и 95 % соответственно. Использование же двух из трех этих антител повышало чувствительность до 72 % и специфичность до 100 %. Наиболее эффективным, по мнению [13], является применение белка теплового шока 70 и глипикана-3.
Таким образом, иммуногистохимическое исследование закономерно считается эффективным методом патогистологического исследования, позволяющим проводить объективную диагностику гепатоцеллюлярной карциномы, дифференциальную ее диагностику с опухолеподобными изменениями и метастазами других новообразований, а также определять прогноз заболевания.