Scientific journal
International Journal of Applied and fundamental research
ISSN 1996-3955
ИФ РИНЦ = 0,564

THE ROLE OF IMMUNOHISTOCHEMICAL STUDY FOR THE HEPATOCELLULAR CARCINOMA DIAGNOSIS

Shchegolev A.I. 1, 2 Mishnev O.D. 2
1 Academician V.I. Kulakov Research Center of Obstetrics, Gynecology and Perinatology, Ministry of Health of Russia
2 N.I. Pirogov Russian National Research Medical University
1542 KB
The analysis of possibilities of application of immunohistochemical markers for the diagnosis and differential diagnosis of hepatocellular carcinoma. Immunohistochemical detection of alpha-fetoprotein, glypican-3, glutamine synthetase and arginase has the most substantial help to confirm the hepatocellular nature of neoplasms. It is shown the features of immunohistochemical expression of carcinoembryonic antigen, cytokeratins, heat shock protein 70 in carcinoma of the liver. Emphasized the special role of the blood vessel markers, which reflect the processes of tumor neoangiogenesis and are correlated with radiation characteristics of liver tumors. Highlighted the role of PCNA and Ki-67 to assess the level of proliferation of tumor cells. It is concluded that the immunohistochemical study of naturally is considered as an effective method for histopathological studies and allows an objective diagnosis of hepatocellular carcinoma, its differential diagnosis of tumor-like changes and metastases from other tumors, and to determine the prognosis of the disease.
liver
hepatocellular carcinoma
dysplastic nodule
immunohistochemistry

Гепатоцеллюлярная карцинома (ГЦК) входит в группу наиболее распространенных злокачественных опухолей с высокими показателями летальности. Самые высокие показатели заболеваемости отмечаются в странах Азии и Африки. В России на конец 2015 года на учете находилось 7360 пациентов, страдающих ГЦК, при этом летальность составила 43,6 % [1]. Единственным методом, позволяющим сделать объективное заключение, определяющее тактику лечения и прогноз заболевания, является гистологическое изучение биопсийного или операционного материала. Существенную, а в ряде случаев и ведущую, роль в диагностике и дифференциальной диагностике играют иммуногистохимические методы исследования [2].

Цель работы: анализ возможностей применения иммуногистохимических маркеров для диагностики и дифференциальной диагностики гепатоцеллюлярной карциномы.

Одним из первых маркеров, внедренных в практику иммуногистохимического ис-следования препаратов ткани печени, был альфа-фетопротеин. Последний представляет собой гликопротеин, который образуется в тканях (преимущественно в печени, кишечнике и желточном мешке) при развитии эмбриона и плода. В этой связи в нормальной ткани печени взрослого человека альфа-фетопротеин не определяется. Наряду с этим альфа-фетопротеин является достаточно специфичным маркером гепатоцеллюлярной карциномы (ГЦК). По данным литературы [16], положительная цитоплазматическая иммуногистохимическая реакция с альфа-фетопротеином отмечается в 25–40 % наблюдений ГЦК, имея нередко при этом очаговый характер. То есть данный иммуногистохимический маркер характеризуется относительно низкой чувствительностью, особенно при низкодифференцированных формах ГЦР. Вместе с тем, определение уровня альфа-фетопротеина в сыворотке крови считается эффективным методом для диагностики и контроля эффективности лечения ГЦК.

Большинство опухолевых клеток, представляющих аденокарциномы, характеризуются диффузной цитоплазматической реакцией с поликлональным раково-эмбриональным антигеном (пРЭА). Поскольку в состав пРЭА наряду с белками входит и билиарный гликопротеин, то иммуногистохимическая картина пРЭА в ткани ГЦК носит специфический характер в виде так называемой мелкой проволочной сетки курятника («chicken-wire fence»). Такая типичная картина канальцев отмечается в 60–90 % наблюдений высоко- и умереннодифференцированных ГЦК и в 25–50 % – низкодифференцированных форм [16, 21]. К сожалению, примерно в половине анализируемых препаратов наблюдается и цитоплазматическое окрашивание опухолевых клеток, что затрудняет проведение дифференциальной диагностики с метастатическими аденокарциномами. При этом моноклональный РЭА в ткани ГЦК не выявляется.

Для подтверждения эпителиальной природы новообразования используются различные цитокератины (ЦК). При этом нормальные и опухолевые гепатоциты характеризуются положительной реакцией на ЦK 8 и 18, в то время как реакция на ЦК 7, 19 и 20 – отрицательная [16, 19]. В этой связи реакция на цитокератины используется для дифференциальной диагностики ГЦГ как от метастазов, так и предопухолевых гепатоцеллюлярных поражений [9]. Действительно, в качестве дифференциально-диагностического признака диспластических узелков высокой степени и ранней ГЦК на фоне цирроза печени используется оценка стромальной инвазии, характерная для ГЦК. В качестве уточняющего метода рекомендуется иммуногистохимическое выявление ЦК 7 и 19: наличие положительной реакции в протоках свидетельствует о псевдоинвазии и не требует верификации ГЦК [10].

Высокочувствительным и высокоспецифичным маркером печеночно-клеточной дифференцировки является антитело HepPar-1, реагирующее с ферментом цикла мочевины карбамил фосфат-синтазой митохондрий печени. В этой связи на иммуногистохимических препаратах положительная реакция проявляется в виде зерен в цитоплазме нормальных и опухолевых гепатоцитов. К сожалению, HepPar-1 не является патогномоничным показателем гепатоцитов, поскольку он также реагирует с митохондриями эпителия канальцев почек и кишечного эпителия. Тем не менее, HepPar-1 признан наиболее адекватным маркером ГЦК печени, так как его экспрессия определяется у 80–90 % больных. При этом интенсивность окрашивания ослабевает по мере снижения степени дифференцировки карциномы, а в ткани низкодифференцированной и скиррозной ГЦК может даже не определяться [16]. Кроме того, положительная очаговая реакция HepPar-1 может наблюдаться при карциноме легкого, пищевода, желудка, толстой кишки, желчного пузыря, шейки матки, надпочечника, а также в ткани меланомы и параганглиомы [17],

Другим маркером печеночно-клеточной дифференцировки является аргиназа (ARG1), катализирующая расщепление аргинина на орнитин и мочевину. Иммуногистохимическими методами определяется в ядре и цитоплазме клеток. По мнению B.C. Yan с соавт. [24], ARG1 обладает большей чувствительностью и специфичностью по сравнению с HepPar-1, особенно при анализе низкодифференцированной ГЦК. Однако имеются указания, что ARG1 может также выявляться в клетках протоковой аденокарциномы поджелудочной железы.

В последнее время для дифференциальной диагностики ГЦК все чаще стали использовать глипикан-3 (GPC3), представителя семейства гепаран-сульфат протеогликанов, сцепленных с клеточной поверхностью при помощи фосфатидилинозитолового якоря. Глипикан-3 определяется в плаценте и печени плода, участвуя в регуляции процессов пролиферации, дифференцировки и апоптоза клеток. В нормальных гепатоцитах печени взрослого человека не определяется. В то же время в ткани ГЦК глипикан-3 выявляется преимущественно в виде цитоплазматического и иногда мембранного или канальцевого окрашивания: в 69 % наблюдений высоко дифференцированных и в 81 % – умеренно дифференцированных форм [13]. Важным моментом является то, что глипикан-3 характеризуется большей чувствительностью по сравнению с HepPar-1 в ткани низкодифференцированной ГЦК [16]. По данным D. Baumhoer с соавт. [11], положительная экспрессия глипикана-3 наблюдается и в отдельных диспластических узелках высокой степени, что свидетельствует об их предопухолевой природе. Наряду с этим, реакция на глипикан-3 отсутствует в ткани гепатоцеллюлярной аденомы, очаговой узловой гиперплазии и при циррозе печени. К отрицательным моментам следует отнести отдельные случаи отрицательной реакции в наблюдениях высоко дифференцированной ГЦК и, наоборот, положительной реакции в ткани меланомы, карциномы желудка, плоскоклеточной карциномы легкого и герминогенных опухолей (хориокарциномы и опухолей желточного мешка) [16].

Еще одним маркером ГЦК является так называемый белок теплового шока 70 (HSP70), входящий в семейство белков теплового шока и имеющий молекулярную массу 70 кДа. Данные белки действуют как внутриклеточные шапероны, а также обладают выраженным антиапоптотическим эффектом [15]. При иммуногистохимическом исследовании HSP70 характеризуется ядерной и цитоплазматической реакцией и отмечается в 78 % наблюдений высоко дифференцированной и в 67 % – умеренно и низкодифференцированной ГЦК. Кроме того, он обнаруживался в 5 % диспластических узелков высокой степени и отсутствовал в диспластических узелках низкой степени [13]. E. Shin с соавт. [23] показали высокую корреляцию выраженной экспрессией HSP70 с размерами ГЦК, степенью гистологической дифференцировки и наличием сосудистой инвазии. Примечательно, что положительная реакция с HSP70 наблюдается и в эпителии желчных протоков, что рекомендуется использовать в качестве внутреннего контроля постановки реакций [13].

Основной функцией глутаминсинтетазы считается участие в детоксикации аммиака. В то же время ген глутаминсинтетазы активируется в результате ядерной транслокации бета-катенина. Видимо, именно поэтому в клетках бета-катенин-активированной гепатоцеллюлярной аденомы отмечается диффузная реакция глутаминсинтетазы. И это, видимо, также является основным фактором повышенного риска злокачественной трансформации данного типа гепатоцеллюлярных аденом. В нормальной же ткани печени положительная реакция глутаминсинтетазы наблюдается лишь в первом и втором слое гепатоцитов, окружающих терминальную печеночную венулу [12]. Развитие и прогрессирование ГЦК сопровождается увеличением частоты иммуногистохимического выявления глутаминсинтетазы в виде диффузной цитоплазматической окраски. Так, глутаминсинтетаза определяется в 14 % диспластических узелков высокой степени, в 59 % наблюдений высоко дифференцированной и в 86 % умеренно дифференцированной ГЦК [13].

Особую роль среди иммуногистохимических показателей ГЦК занимают маркеры кровеносных сосудов, поскольку наряду с диагностическими возможностями они могут использоваться и в качестве факторов прогноза. Действительно, многошаговый гепатоканцерогенез от предракового поражения до инвазивной формы опухоли сопровождается изменениями, как в структуре сосудов, так и ее кровоснабжении [6]. Так, по данным иммуногистохимического исследования эндотелиоциты нормальных синусоидов и при циррозе печени характеризуются отрицательной реакцией с антителами CD31 и CD34, в то время как эндотелиальные клетки сосудов в ткани диспластических узелков и ГЦК имеют положительную экспрессию данных маркеров. То есть реакцию с CD34 не рекомендуется использовать для дифференциальной диагностики диспластических узелков и ранней ГЦК.

Прогрессирующие процессы капилляризации синусоидов взаимосвязаны и со степенью злокачественности новообразования. В участках высокодифференцированной ГЦК встречаются как обычные синусоиды, так и микрососуды капиллярного типа, а при низкодифференцированной форме – только капилляры [7]. При этом синусоиды в высокодифференцированной ГЦК характеризуются неполной капилляризацией: положительные реакции на CD34 и ламинин являются слабыми и только местами. В процессе дедифференцировки отмечается увеличение площади участков с CD34-положительной реакцией и развитие признаков полной капилляризации, как это отмечается в умеренно-дифференцированном ГЦК. Согласно проведенным нами исследованиям [8], морфологические показатели васкуляризации ткани ГЦК зависят от размера узлов и степени гистологической дифференцировки. Максимальные значения количества и суммарной площади сечения CD34 положительных сосудов установлены в новообразованиях диаметром не более 5 см, а наименьшие – в опухолях размером более 10 см. Наибольшие значения показателя васкуляризации выявлены в ткани высоко дифференцированной ГЦК, а наименьшие – в наблюдениях низкодифференцированных карцином.

Следует также добавить, что изменения неоангиогенеза отражаются и на лучевых характеристиках образований: диспластические узелки обычно выглядят как изо- или гиповаскулярные участки, ГЦК же имеет характеристики гиперваскулярности в артериальную фазу исследования [14]. При этом лучевые характеристики выраженной ГЦК зависят также от размеров опухолевого узла [5] и степени гистологической дифференцировки [3, 4].

Важным моментом морфологического изучения ткани опухоли является оценка степени пролиферации ее клеток. К основным иммуногистохимическим маркерам, используемым для определения индексов пролиферации, относятся PCNA (ядерный антиген пролиферирующих клеток) и Ki-67, которые определяются в ядрах пролиферирующих клеток. При этом Ki-67 не экспрессируется в фазу G0. При иммуногистохимическом анализе PCNA положительных клеток было показано прогрессирующее увеличение их количества в ряду, отражающим этапы гепатоканцерогенеза: регенеративные узелки (2,6 ± 1,35), диспластические узелки низкой степени (15,3 ± 10,5), диспластические узелки высокой степени (25,4 ± 5,25), маленькая ГЦК (34,9 ± 15,7) [22]. Дальнейшее прогрессирование ГЦК (стадия I – IV) тоже сопровождается с увеличением количества Ki-67 положительных клеток [20]. При этом на основании проведенного мета-анализа Y. Luo с соавт. [18] установили, что более высокие значения индекса пролиферации клеток (по Ki-67) сочетаются не только с более высокой степенью злокачественности, но и с бoльшими размерами и количеством узлов, наличием сосудистой инвазии и метастазов.

Характеризуя иммуногистохимические маркеры, применяемые для верификации ГЦК, необходимо добавить, что эффективность такой диагностики повышается при использовании несколько антител. Как мы уже указывали, чувствительность и специфичность глутаминсинтетазы при диагностике высоко дифференцированной ГЦК составляет 59 % и 86 % соответственно, глипикана-3 – 69 % и 91 %, белка теплового шока 70–78 % и 95 % соответственно. Использование же двух из трех этих антител повышало чувствительность до 72 % и специфичность до 100 %. Наиболее эффективным, по мнению [13], является применение белка теплового шока 70 и глипикана-3.

Таким образом, иммуногистохимическое исследование закономерно считается эффективным методом патогистологического исследования, позволяющим проводить объективную диагностику гепатоцеллюлярной карциномы, дифференциальную ее диагностику с опухолеподобными изменениями и метастазами других новообразований, а также определять прогноз заболевания.