С возрастом в коже происходят закономерные изменения количества, морфологической структуры, функциональных возможностей и пролиферативной активности клеток – дермальных фибробластов, кератиноцитов, меланоцитов и др. [6, 10]. В эпигенетических факторах старения особое внимание уделяется действию свободных радикалов, их повреждающему эффекту на клеточные структуры в результате окислительной модификации белков и нуклеиновых кислот, переокисления липидов [6, 8]. Ряд авторов считают белки главными мишенями для активных форм кислорода из-за своей высокой чувствительности к свободным радикалам и распространенности в биологических материалах [4, 8]. Нельзя упускать из внимания при этом ответственность белков за большинство функциональных процессов в клетке. Окислительная модификация белков связана как с процессами ковалентного их преобразования, вызванного непосредственным воздействием активных форм кислорода, так и последствиями взаимодействия с вторичными побочными продуктами перекисного окисления липидов (малоновый диальдегид, 4-гидрокси-2-ноненаль [4, 7]. Формирование окислительной модификации белков происходит и при смещении баланса антиоксидантов и проксидантов в пользу вторых в условиях истощения антиоксидантной системы, которое наблюдается при старении [2, 8, 11]. Окислительной модификации могут подвергаться радикалы почти всех аминокислот. Это сопровождается изменением пространственной организацией белковых молекул, повышением их агрегации, фрагментации, гидрофобности и чувствительности к протеолизу. При старении происходят существенные модификации белков экстрацеллюлярного матрикса, приводящее к понижению в дерме коллагенов типа I, III и VII. В отличии от нефибриллярных белков при старении структура коллагена изменяется в сторону повышения их жесткости и устойчивости к действию протеиназ [9].
Для коррекции фотостарения и возрастных изменений кожи в косметологической практике широко применяются препараты гиалуроновой кислоты (ГК). ГК, являясь одним из важных биополимеров дермы, участвует в регуляции водного баланса, обеспечении тургора, тонуса и эластичности кожи, процессов апоптоза, пролиферации и миграции клеток, обладает биостимулирующим действием на обменные процессы, способствует увеличению объема межклеточного вещества дермы, его структурных элементов вследствие активации биосинтетической функции фибробластов, обладает противовоспалительными свойствами, участвует в обеспечении защиты клеток и внутриклеточных структур от окислительной деградации [1, 5].
Цель исследования
Охарактеризовать интенсивность окислительной модификации белков кожи при внутридермальном курсовом введении препарата нативной высокомолекулярной гиалуроновой кислоты.
Материалы и методы исследования
Опыты проведены на самках крыс молодого (4-5 месяцев) и зрелого (11-12 месяцев) возраста. Животные содержались в условиях вивария при сбалансированном питании и естественном освещении. При проведении экспериментов были соблюдены этические нормы и рекомендации по гуманному отношению к животным, введённые Европейской конвекцией по защите позвоночных животных, используемых в экспериментальных и других научных целях, а также приказ Минздрава РФ № 267 «Об утверждении правил лабораторной практики» от 19.06.2003 г.
Эксперименты были проведены в два этапа. Вначале оценивали выраженность окислительной модификации белков в коже интактных крыс молодого и зрелого возрастов. На втором этапе изучали влияние препарата «JvedermRHydrateTM «(Франция) на эти процессы в коже зрелых животных. Препарат содержит 13,5 мг геля гиалуроновой кислоты с молекулярной массой 1 млн. дальтон и 9 мг маннитола в 1мл фосфатного буфера рН 7,2. Введение препарата осуществляли под лёгким эфирным наркозом внутридермально техникой мезотерапии на боковую поверхность туловища (площадь 3х3 см) после удаления шерстяного покрова из расчёта 0,06 мл на 100 г массы тела трижды на 1-е, 3-и и 6-е сутки эксперимента. В контрольную область кожи (другой бок туловища) аналогичным образом инъецировали стерильный физиологический раствор. Из эксперимента животных выводили пол лёгким эфирным наркозом на 2-е, 4-е, 7-е, 21-е и 37-е сутки опыта. В коже в областях инъекции препарата гиалуронана и физиологического раствора определяли уровень окислительной модификации белков по регистрации 2,4-динитрофенилгидразонов спектрофотометрически при 270 нм (алифатические альдегиддинитрофенилгидразоны нейтрального характера), при 370 нм (алифатические кетондинитрофенилгидразоны нейтрального характера), при 430 нм (алифатические кетондинитрофенилгидразоны основного характера) [1, 4]. Для оценки активности антиоксидантной системы изучали содержание карбонилированных белков разного характера в ответ на индукцию свободнорадикального окисления системой Fe2+/H2O2 в пробирочных условиях.
Статистическую обработку результатов осуществляли с использованием пакета программ Statistica 6,0 forWindows, рассчитывали медиану, верхний и нижний квартили, межгрупповые различия показателей оценивали по U-критерию Манна-Уитни.
Результаты исследования и их обсуждение
Результаты исследования (табл. 1) белков кожи группы животных зрелого возраста показывают, что некоторое увеличение содержания алифатических альдегиддинитрофенилгидразонов (а АДНФГ) по сравнению с группой крыс молодого возраста не достигает статической значимости (Р = 0,1259), но базальные уровни алифатических кетондинитрофенилгидразонов (а КДНФГ) и нейтрального, и основного характера превалируют (Р = 0,0262 и Р = 0,0443 соответственно). При индукции образования радикалов путём добавления в реакционную среду пероксида водорода и ионов двухвалентного железа наблюдалось более интенсивное образование альдегидных продуктов карбонилирования белков кожи животных молодого возраста, отражая в коже молодых большую емкость антиоксидантной системы. Однако при определении содержания кетондинитрофенилгидразонов на фоне индукции свободнорадикальных процессов существенных различий между возрастными группами не обнаружилось.
Таблица 1
Уровень окислительной модификации белков кожи у самок крыс разных возрастных групп
|
Показатели |
Возрастные группы |
P |
|
|
Молодые (4-5 мес.), n = 10 |
Зрелые (11-12 мес.), n = 12 |
||
|
Алифатические АДНФГ, Ед/г белка |
0,478 [0,452-0,521] |
0,503 [0,448-0,533] |
0,1259 |
|
Алифатические АДНФГ при индукции, Ед/г белка |
1,206 [0,943-1,301] |
0,964 [0,758-1,281] |
0,0134 |
|
Алифатические КДНФГ нейтрального характера (мкмоль/г белка) базальный уровень (б) |
16,8 [12,6-20,8] |
19,6 [14,2-23,6] |
0,0262 |
|
Алифатические КДНФГ нейтрального характера (мкмоль/г белка) при индукции (и) |
186,3 [174,2-199,3] |
182,4 [166,5-200,8] |
0,8634 |
|
Алифатические КДНФГ основного характера (мкмоль/г белка) базальный уровень (б) |
4,15 [3,80-4,94] |
5,11 [4,61-6,04] |
0,0443 |
|
Алифатические КДНФГ основного характера (мкмоль/г белка) при индукции (и) |
26,4 [19,3-31,2] |
24,9 [16,6-26,3] |
0,6217 |
В целом анализ полученных результатов позволяют констатировать, что имеются возрастные различия в интенсивности окислительной модификации белков кожи. Ряд авторов отмечает, что альдегидные производные карбонилирования белков являются маркёрами их ранней окислительной модификации, а кетонные производные – маркёрами более поздних изменений, характеризующие степень окислительной деструкции белковой молекулы [1, 4]. Исходя из этих позиции, можно предположить, что с возрастом в белках кожи увеличивается содержание белков, подверженных более глубокой окислительной модификации.
Результаты изучения влияния препарата ГК на интенсивность карбонилирования белков кожи животных зрелого возраста представлены в табл. 2.
Таблица 2
Влияние интердермального введения препарата нативного высокомолекулярного гиалуронана на интенсивность окислительной модификации белков (мкмоль/г белка) кожи крыс зрелого возраста
|
Группа животных |
а КДНФГ нейтрального характера |
а КДНФГ основного характера |
|||
|
Базальный уровень |
При индукции |
Базальный уровень |
При индукции |
||
|
Интактные, n = 12 |
19,6 [14,2-23,6] |
182,4 [166,5-200,8] |
5,11 [4,61-6,04] |
24,9 [16,6-26,3] |
|
|
2-е сутки, n = 10 |
К |
27,6 [19,8-34,1] P = 0,036 |
176,8 [164,0-184,3] P = 0,324 |
8,18 [5,12-10,13] P = 0,017 |
21,4 [17,3-25,8] P = 0,046 |
|
Оn |
22,8 [14,8-25,6] P = 0,124 P1 = 0,034 |
201,4 [170,6-230,4] P = 0,135 P1 = 0,076 |
6,03 [4,12-7,86] P = 0,079 P1 = 0,042 |
27,7 [20,3-33,8] P = 0,043 P1 = 0,036 |
|
|
4-е сутки, n = 8 |
К |
29,6 [24,3-36,2] P = 0,011 |
170,6 [160,2-182,3] P = 0,050 |
8,76 [5,3-11,16] P = 0,020 |
21,9 [19,5-30,4] P = 0,038 |
|
Оn |
28,3 [20,3-33,6] P = 0,033 P1 = 0,663 |
214,7 [182,3-221,6] P = 0,067 P1 = 0,042 |
7,07 [4,9-9,15] P = 0,013 P1 = 0,036 |
28,1 [21,4-34,6] P = 0,047 P1 = 0,029 |
|
|
7-е сутки, n = 10 |
К |
29,5 [23,6-33,8] P = 0,021 |
168,2 [160,1-181,6] P = 0,042 |
9,15 [5,71-12,09] P = 0,012 |
20,4 [16,6-24,2] P = 0,035 |
|
Оn |
25,7 [21,4-30,6] P = 0,040 P1 = 0,044 |
224,0 [192,3-241,6] P = 0,038 P1 = 0,039 |
8,06 [4,77-10,16] P = 0,011 P1 = 0,05 |
28,0 [20,9-33,6] P = 0,045 P1 = 0,031 |
|
|
21-е сутки, n = 10 |
К |
19,9 [15,6-24,4] P = 0,709 |
180,5 [159,4-200,5] P = 0,897 |
5,81 [4,02-7,16] P = 0,264 |
23,6 [18,3-31,5] P = 0,794 |
|
Оn |
19,0 [16,6-22,8] P = 0,687 P1 = 0,831 |
194,9 [175,6-197,3] P = 0,068 P1 = 0,218 |
6,02 [4,72-7,16] P = 0,121 P1 = 0,727 |
26,3 [24,1-28,8] P = 0,741 P1 = 0,071 |
|
|
37-е сутки, n = 10 |
К |
20,2 [14,7-25,2] P = 0,707 |
188,8 [172,4-201,6] P = 0,713 |
5,67 [3,85-6,44] P = 0,426 |
22,8 [17,3-26,6] P = 0,631 |
|
Оn |
17,4 [13,4-22,7] P = 0,051 P1 = 0,047 |
196,3 [180,3-214,3] P = 0,061 P1 = 0,233 |
5,05 [3,56-5,72] P = 0,831 P1 = 0,374 |
26,8 [20,1-30,6] P = 0,637 P1 = 0,045 |
|
Примечание: К-контрольный участок кожи, Оп-опытный участок кожи.
На 2-е, 4-е и 7-е сутки эксперимента на следующие сутки после трёхкратного введения препарата ГК и физиологического раствора в зонах инъекций наблюдался статистически значимое увеличение а КДНФГ нейтрального и основного характера. На более поздние сроки наблюдения (21-е и 37-е сутки) интенсивность карбонилирования белков кожи не отличалась от уровня животных интактной группы. В то же время на участках введения препарата ГК на 2-е, 4-е и 7-е сутки базальный уровень аКДНФГ основного характера, на 2-е и 7-е сутки – нейтрального характера она была статистически значимо ниже, чем в контрольной зоне.
При индукции свободнорадикальных процессов добавлением в пробирку пероксида водорода и ионов двухвалентного железа содержание аКДНФГ нейтрального характера на 4-е и 7-е сутки, основного характера на 2-е, 4-е и 7-е сутки на участках интердермального введения препарата ГК было статистически значимо больше, чем в контрольных участках, свидетельствуя о более высоком уровне антиоксидантной защиты.
Увеличение интенсивности окислительной модификации белков в участках внутридермального введения препарата ГК и физиологического раствора на следующие сутки после проведения процедуры мезотерапии, по всей видимости, связано с характером тканевого ответа кожи с развитием воспалительной реакции на травмирующее воздействие. При подкожном введении экспериментальным животным геля немодифицированной высокомолекулярной ГК некоторые авторы [7] в местах инъекции на первые сутки наблюдали развитие асептического воспаления с нейтрофильной инфильтрацией, которая позднее сменялось лимфоцитарно-макрофагальной.
Таким образом, результаты проведённых исследований позволяют придти к заключению, что интердермальное инъецирование методом мезотерапии в первые сутки после процедуры приводит к активации окислительной модификации белков кожи в участках введения препарата. Немодифицированная высокомолекулярная гиалуроновая кислота при этом проявляет антиоксидантные свойства, снижая содержание в коже продуктов карбонилирования белков.
Выводы
1. При биологическом старении в коже экспериментальных животных происходит увеличение окислительной модификации белков, о чём свидетельствует нарастание с возрастом содержания продуктов карбонилирования.
2. Интердермальное введение препарата высокомолекулярной нативной гиалуроновой кислоты способствует снижению содержания алифатических кетондинитрофенилгидразонов белков кожи экспериментальных животных зрелого возраста, проявляя антиоксидантные свойства.