Scientific journal

International Journal of Applied and fundamental research

ISSN 1996-3955

ИФ РИНЦ = 0,593

На сегодняшний день вопросы совершенствования иммунодиагностических средств, направленных на обнаружение возбудителей особо опасных инфекций, в частности возбудителя мелиоидоза, приобретают все большую актуальность [4]. Наиболее приоритетным направлением совершенствования методов выявления возбудителя мелиоидоза является разработка средств обнаружения этого особо опасного микроорганизма, приготовленных на основе МКА. Использование МКА к диагностически значимой антигенной мишени патогенной буркхольдерии позволяет добиться таких параметров качества, как высокая чувствительность, специфичность изделия медицинского назначения и его стандартизация [3].

Для изготовления иммуноферментной тест-системы на основе МКА, отвечающей современным требованиям, необходим тщательный подбор ингредиентов для каждого из этапов постановки сэндвич-варианта ИФА. Моноклональные антитела должны быть высокоафинными и при этом не должны обладать кросс-реактивностью. В последние годы одной из приоритетных мишеней для обнаружения B. pseudomallei является экспонированный на поверхности микробных клеток гликопротеин с м.м. 200 kDa – маркер вирулентных штаммов буркхолдерий [5].

Данная работа посвящена изучению свойств МКА к антигену 200 kDa B. pseudomallei, использованных для создания на их основе иммуноферментной тест системы, способной выявлять искомый антиген в различных объектах.

Цель исследования. Подбор оптимальных ингредиентов (МКА) для сэндвич-варианта ТИФМ: антител первого порядка для сорбции на твердой фазе и антитела второго порядка для изготовления ИПК.

Материалы и методы исследования

В работе были использованы линии мышиных перевиваемых гибридных клеток-продуцентов МКА против антигена 200 kDa возбудителя мелиоидоза из коллекции лаборатории иммунодиагностики ФКУЗ Волгоградский научно-исследовательский противочумный институт Роспотребнадзора, постоянно сохраняемые в жидком азоте при – 196°С и инбредные белые мыши линии BALB/c, массой 12 – 16 г обоих полов.

Моноклональные антитела к гликопротеину 200 kDa различной эпитопной направленности накапливали в препаративных количествах в процессе культивирования in vitro и in vivo, последовательно размораживая все варианты гибридом-продуцентов [2]. Клетки культивировали при 37oC в атмосфере 5 % СО2 и 70–80 % влажности с применением среды RPMI-1640 с добавлением 15 % эмбриональной телячьей сыворотки, L-глютамина, пирувата натрия. Антителопродукцию контролировали с помощью непрямого варианта ТИФМ по стандартной методике.

Накопление антител in vivo осуществляли с помощью внутрибрюшинного введения 1–5•106 клеток гибридом мышам линии BALB/c, предварительно праймированным пристаном. МКА выделяли из асцитической жидкости (АЖ) мышей с помощью метода трёхкратного переосаждения белка сульфатом аммония. Специфическую активность МКА оценивали в непрямом методе флюоресцирующих антител, подтверждали их гомогенность и видовую принадлежность с помощью реакции иммунодиффузии.

Изотипы антител определяли с помощью набора реагентов фирмы SIGMA согласно прилагаемой инструкции (Antigen-mediated ELISA). Данные о конкурентных взаимоотношениях МКА были получены с помощью метода, описанного Friguet B. с соавт.[8]. Аффинность МКА вычисляли по методике Beatty J.D. [6].

Электрофоретический анализ антигенных препаратов проводили на приборе «Mini-PROTEAN 3» производства «Bio-Rad Laboratories, inc.». В качестве стандартов молекулярных масс использовали наборы маркерных белков (ООО «Хеликон», Москва).

Рабочее разведение и отбор МКА для проведения иммуноблоттинга производили с помощью прямого варианта dot-иммуноанализа с экспериментальными ИПК по стандартной методике (Bode L., 1984). Иммуноблоттинг проводили в ячейке прибора «Mini-Trans-Blot» фирмы «Bio-Rad Laboratories, inc.» (США). Электрофореграммы и иммунограммы сканировали в приборе «Epson expression™ 10000 XL» («Epson»), изображения анализировали с помощью компьютерной программы «TotalLab TL120»© («TotalLab Ltd.»).

Иммунопероксидазные конъюгаты (ИПК) получали по методу Nakane P.K., Kawaoi A. [7]. Рабочее разведение каждого из них определяли, используя методику шахматного титрования. Биотинилирование моноклональных иммуноглобулинов осуществляли при помощи биотин-N-гидросукцинимидного эфира (Sigma, США).

Статистическую обработку результатов опытов проводили с помощью методов вариационной статистики, а также компьютерной программы «Statistica 6.0».

Результаты исследования и их обсуждение

Коллекция гибридных клонов, продуцирующих МКА против антигена 200 kDa B. pseudomallei, была последовательно выведена из криоконсервированного состояния и сразу после размораживания оценена по показателям жизнеспособности. Показатели свидетельствовали о хорошем состоянии гибридом-продуцентов МКА. Для быстрого и эффективного восстановления функции антителопродукции гибридомы подвергали реклонированию.

Культивирование гибридных клеток in vitro осуществляли в ростовой среде с добавлением следующих компонентов: ЭТС, глутамин, пируват, антибиотики и витамины. На всех этапах культивирования оценивали интенсивность антителопродукции в ТИФМ. Гибридомы, накопленные in vitro, использовали для последующего введения мышам (накопление МКА in vivo).

Полученные после этапа накопления in vivo данные свидетельствовали о том, что каждая из гибридом обладает различной прививаемостью, антителопродукцией и способностью к образованию асцита.

Накопленные образцы МКА необходимо было проверить в качестве ингредиентов для сэндвич-варианта иммуноферментного анализа. Подбирали индивидуальные антитела или их смеси, выполняющие роль антител первого порядка (АТ1), которые, будучи адсорбированными на твердой фазе, обеспечат активный захват антигена-мишени, и антитела второго порядка (АТ2) для приготовления ИПК. При выборе варианта МКА, необходимо учитывать не только высокую специфичность антитела, но и величину аффинности и индекс аддитивности, а также характеристики, указывающие на то, что МКА будет направлено против эпитопа, который представлен с высокой плотностью на искомом антигене.

Изотипирование МКА, из которых была сформирована рабочая панель, показало, что девять из них принадлежат к классу IgM (3C6, 4А10, 5C2, 5С9, 5Н11, 6A11, 6В7, 6Е7, 7А8) и один – к IgА (6F9).

Постановка ТИФМ с различными вариантами МКА и контрольным антигеном (формамидный экстракт B. pseudomallei 100) позволила определить варианты, наиболее активно взаимодействующие с этим антигеном. Было установлено, что более высокой активностью обладали образцы антител, выделенные из АЖ мышей, в отличие от антител, полученных из среды культивирования гибридом. В дальнейшем это и определило выбор образцов иммуноглобулинов, изолированных из АЖ мышей, в качестве ингредиентов для создания тест-системы.

Непрямой метод флуоресцирующих антител (НМФА) продемонстрировал доказательство поверхностной локализации эпитопов, узнаваемых МКА на микробной клетке B. pseudomallei 100. Также с помощью этого метода были получены различные данные об удельной активности МКА.

Видовая принадлежность всех образцов МКА и их гомогенность были подтверждены с помощью реакции иммунодиффузии в геле (РИД) с использованием антивидовой кроличьей сыворотки.

Дальнейшая работа была посвящена изучению эпитопной плотности и эпитопной направленности полученных МКА в иммуноблоттинге с образцами антигенов B. pseudomallei 100. Результаты свидетельствовали о том, что эпитопы, гомологичные МКА 5С2, были обнаружены в составе фракций антигена с м.м. 37, 36, 35, 34, 30, 26, 24, 21, 18,4, т.е. эпитопная плотность узнаваемых данным МКА участков велика (табл. 1).

Таблица 1

Эпитопная направленность МКА к антигенам B. pseudomallei

В качестве антител первого порядка использовали как индивидуальные образцы МКА, так и их смеси (от 3 до 5 вариантов МКА), которые имитировали поликлональный эффект за счет применения иммуноглобулинов различной эпитопной направленности. Оптимальный состав смеси первого порядка выбирали, ориентируясь на данные о конкурентных взаимоотношениях пар антител и о величинах их аффинности.

Для определения аддитивности каждого конкретного из десяти МКА, а также выяснения характера взаимоотношений пар МКА с антигеном 200 kDa Burkholderia pseudomallei 100 использовали конкурентный ТИФМ. В данном методе учет результатов идет по относительному показателю, выраженному в процентах. Эта условная величина позволяет определить, на каком расстоянии эти эпитопы располагаются. Результаты представлены в табл. 2.

Таблица 2

Индексы аддитивности для МКА 2А6, 3C6, 5C2

По результатам этой реакции был выбран оптимальный вариант смеси МКА различной эпитопной направленности, которые не конкурировали за взаимодействие с одним и тем же сайтом связывания на антигене. Наиболее успешной композицией была признана смесь МКА 3С6+5С2+2А6. Результаты определения индексов аддитивности этих пар МКА (>30 %) свидетельствуют о том, что эпитопы, гомологичные каждому из антител, расположены на значительном расстоянии друг от друга.

Аффинность количественно измеряли с помощью непрямого варианта ТИФМ по методике по Beatty J.D. [6]. Для этого производили двукратное титрование образцов МКА в лунках планшета с контрольной серией антигена 200 kDa B. pseudomallei 100 (серия 23) и строили графики зависимости величины оптической плотности от логарифма разведения и вычисляли разведение МКА, которое соответствовало двукратному уменьшению количества связавшихся с носителем антител. Полученные величины констант аффинности (Kaff) варьировали от 9·105 до 2·108 М-1, что свидетельствовало о различной прочности связывания МКА с гомологичными им участками контрольного АГ. Kaff МКА 3C6, 5C2, 2A6 были равны 9·105 М-1, 2·108 М-1 и 8·107 М-1 соответственно.

Установлено, что нагрузка твердой фазы МКА в концентрации 10 и 20 мкг/мл обеспечивала одинаковую чувствительность тест-системы, а повышение до 50 мкг/мл существенно снижало чувствительность тест-системы.

Для приготовления АТ второго порядка, основы для ИПК, были использованы восемь вариантов МКА, из них семь (3С6, 4А10, 5С2, 6А11, 6E7, 6F9, 7А8) подошли по параметрам качества, иммунопероксидазные конъюгаты (ИПК) были проверены методом шахматного титрования в ТИФМ. ИПК на основе 2А6 и 5С2 достигали наибольшей чувствительности тест-системы.

После завершения этапов оптимизации условий подготовки твердой фазы и получения иммунопероксидазных конъюгатов и их характеристики, была подобрана наиболее эффективная композиция ингредиентов тест-системы: АТ1 (3С6+5С2+2А6) в концентрации 20 мкг/мл на твердой фазе + антиген + АТ2 (ИПК 5С2 в рабочем разведении).

Разработанная экспериментальная тест-система была изучена по параметрам чувствительности и специфичности. Все этапы «сэндвич» – варианта твёрдофазного иммуноферментного метода (ТИФМ) проводили согласно общепринятым рекомендациям [1].

Установлено, что чувствительность тест-системы в реакции со стандартным антигеном составляла 2,5 мкг/мл. Обнаружение АГ 200 kDa в водно-солевых экстрактах (ВСЭ) капсулообразующих буркхольдерий II-III групп патогенности (B. pseudomallei, B. mallei, B. cepacia) подтвердило ее пригодность для оценки содержания этого антигена в них (рисунок).

Чувствительность обнаружения антигена 200 kDa в ВСЭ патогенных буркхольдерий в ТИФМ, мкг/мл

Следует отметить, что чувствительность выявления антигена 200 kDa возбудителя мелиоидоза в ВСЭ гетерологичных микроорганизмов была значительно ниже, чем при выявлении его в пробах, приготовленных из микробных клеток штаммов гомологичного вида.

Данные, представленные на рисунке, позволяют сделать вывод о том, что экспериментальная тест-система пригодна для анализа водно-солевых экстрактов антигенов с точки зрения содержания антигена 200 kDa.

Выводы

В результате проделанной работы было установлено, что каждый вариант МКА из панели иммуноглобулинов к гликопротеину 200 kDa возбудителя мелиоидоза обладает индивидуальными характеристиками, которые свидетельствуют о различной эпитопной направленности этих антител и их высокой специфической активности. Оптимизация условий конструирования тест-системы позволила определить состав смеси МКА (3C6+5C2+2A6), сорбируемой на твердой фазе, и подобрать высокоактивное детектирующее антитело (5С2), которое в составе ИПК обеспечило тест-системе высокую чувствительность выявления антигена 200 kDa, равную 2,5 мкг/мл.