На протяжении последних десятилетий появилось достаточное количество исследований, посвященных поиску этиологических факторов формирования и развития искривлений позвоночного столба у детей. Возникающие деформации позвоночника могут быть обусловлены, как аномалией развития тел позвонков, так и появляться в процессе роста и развития ребёнка при анатомически правильной их форме. При этом в первом случае выявляемые после рождения ребенка искривления позвоночника являются врождёнными, во втором – идиопатические.
Общеизвестно, что сколиоз является мультифакторным заболеванием, развитие которого обусловлено как генетической предрасположенностью, так и воздействием различных факторов внешней среды [5]. В качестве «кандидатных» генов, оказывающих определенное воздействие на формирование деформаций позвоночника, рассматриваются гены, которые вовлечены в процессы костного метаболизма и остеогенеза. Среди многочисленного числа генов, относящихся к этой группе, наиболее значимыми являются ген рецептора витамина Д(VDR) и ген коллагена 1 типа (COL1A1) [1, 4].
Витамин Д и его метаболиты играют ключевую роль в костном обмене и фосфорно-кальциевом гомеостазе, влияют на рост и дифференцировку клеток в различных органах-мишенях [3, 7]. Кроме того известно, что витамин Д является лигандом для ядерного рецептора, кодируемого геном VDR, являющегося регулятором активности многих генов-мишеней путём его взаимодействия со специфическими последовательностями ДНК в промоторных областях этих генов [6]. Установлено, что под воздействием кальцитриола, или витамина Д3, снижается экспрессия гена коллагена I типа [2, 8].
Анализ результатов ряда научных работ позволил сделать вывод, что структурные изменения генов рецептора витамина Д и коллагена 1 типа могут быть связаны с формированием и прогрессированием деформаций позвоночника различного генеза. В связи с этим данное исследование является актуальным с точки зрения проведения молекулярно-генетического тестирования – 3731А/G (Cdx2) и +61968T/С (TaqI) гена VDR и –1997G/T (PCOL2) и +1245G/T (Sp1) гена COL1A1 у пациентов со сколиотической деформацией позвоночника различной этиологии и здоровых детей с изучением распределения частот аллелей и генотипов по полиморфизмам и анализу взаимосвязи молекулярно-генетических маркеров с развитием сколиоза.
Материалы и методы исследования
Проведено обследование 195 детей с врождённым сколиозом в возрасте от 6 месяцев до 17 лет. В первую группу сравнения вошли 145 пациентов с идиопатическим сколиозом II – IV степеней тяжести в возрасте от 12 до 18 лет, во вторую группу – 278 детей в возрасте от 1 года до 18 лет, у которых на момент осмотра отсутствовали признаки искривления позвоночного столба. В табл. 1 представлены результаты распределения исследуемых групп детей по полу и возрасту.
Таблица 1
Распределение детей в исследуемых группах по полу и возрасту
|
Гр. Пол |
Врождённый сколиоз n, % |
Средний возраст (годы) |
Идиопатический сколиоз n, % |
Средний возраст (годы) |
Контроль n, % |
Средний возраст (годы) |
|
Мальчики |
63 (40,9) |
7,2 (+0,4) |
15 (10,3) |
15,4 (+0,1) |
124 (44,7) |
11,2 (+0,2) |
|
Девочки |
91 (59,1) |
130 (89,7) |
154 (55,3) |
|||
|
Всего |
154 (100) |
145 (100) |
278 (100) |
Материалом исследования служила ДНК, выделенная из лейкоцитов периферической крови стандартным методом фенольно-хлороформной экстракции. Определение TaqI,, Cdx2 полиморфизмов гена рецептора витамина D (VDR) осуществлялось методом ПДРФ с использованием рестриктаз TaqI,, Cdx2. Определение Sp1 полиморфизмов гена αI цепи коллагена I типа (COL1A1) проводили методом ПДРФ с использованием рестриктазы Bse1I. Определение 1997G/T (rs1107946) полиморфизма гена гена αI цепи коллагена I типа (COL1A1) проводили методом ПДРФ с использованием рестриктазы BstMAI. Статистическая обработка данных осуществлена в программе Statistica 5.5. Для оценки соответствия распределения генотипов по изученным полиморфным маркерам равновесию Харди-Вайнберга и для сравнительного анализа распределения частот аллелей и генотипов по изученным полиморфизмам в группах пациентов с врожденным и идиопатическим сколиозом, а также в группе детей, не имеющих сколиотической деформации, использовали критерий χ² Пирсона.
Результаты исследования и их обсуждение
Распределение частот аллелей и генотипов генов VDR и COL1A1 по всем изученным полиморфизмам в анализируемых выборках обследованных пациентов соответствовало равновесию Харди-Вайнберга. Результаты распределения аллелей и генотипов по полиморфизмам гена VDR – +61968T>C, –3731А>G и гена COL1A1– +1245 G>T, –1997 G>T у пациентов, страдающих врожденным и приобретенным сколиозом, и детей, не имеющих деформаций позвоночника, представлены в табл. 2.
Сравнительный анализ частот аллелей и генотипов по полиморфизму +61968T>C гена VDR в группах пациентов со сколиотической деформацией позвоночника и детей, не имеющих деформаций позвоночника, выявил различия в их распределении. Среди пациентов с врожденным сколиозом чаще встречались дети- носители аллеля «t(C)» (0,377 vs 0,292; χ²=6,51; d.f.=1; p=0,01) и генотипа «tt (CC)» (0,149 против 0,081; χ²=6,79; d.f.=2; p=0,03) по сравнению с детьми, не имеющих сколиотической деформации позвоночника. Отношения шансов для носителей генотипа «ТТ» составило 0,66 (95 %СI 0,44–0,99), а для генотипа «tt(CC)» – 1,99 (95 %СI 1,07–3,70). Выявлено, что носительство аллеля t гена VDR можно рассматривать как маркер повышенного риска развития врождённого сколиоза. Сравнительный анализ распределения аллелей и генотипов по полиморфизму –3731А>G гена VDR и полиморфизмам (+1245 G>T, –1997 G>T) гена COLA1 не выявил достоверных различий в группах детей, имеющих врожденный и идиопатический сколиоз. Необходимо отметить, что не было выявлено достоверных различий в распределении аллей и генотипам по изученным полиморфным маркерам при сравнении их частот среди пациентов с различными типами сколиоза и контрольной группой. Проведён анализ распределения сочетания аллей и генотипов гена VDR (+61968T>C, –3731А>G) в группах пациентов с врожденным и идиопатическим сколиозом и в группе детей без деформации позвоночника.
Таблица 2
Распределение частот аллелей и генотипов генов VDR (+61968T>C, –3731А>G) и COLA1 (+1245 G>T, – 1997 G>T) в группах пациентов с врожденным, идиопатическим сколиозом и без деформации позвоночника
|
Гены, аллели, генотипы |
Частоты аллелей и генотипов |
||||
|
ВС |
Контроль |
ИС |
|||
|
VDR |
|||||
|
TaqI (+61968T/C) |
N=154 |
N=271 |
N=145 |
||
|
T/T |
0,396 |
0,498 |
0,448 |
||
|
T/t (T/C) |
0,455 |
0,421 |
0,428 |
||
|
t/t (C/C) |
0,149 |
0,081 |
0,124 |
||
|
Статистика |
χ²=6,79; d.f.=2; p=0,03 |
χ²=2,31; d.f.=2; p=0,31 |
|||
|
T* |
0,623 |
0,708 |
0,662 |
||
|
t** |
0,377 |
0,292 |
0,338 |
||
|
Статистика |
χ²=6,51; d.f.=1; p=0,01 |
χ²=1,91; d.f.=1; р=0,17 |
|||
|
Cdx2(-3731А/G) |
N=154 |
N=269 |
N=145 |
||
|
A/A |
0,052 |
0,026 |
0,028 |
||
|
A/G |
0,266 |
0,279 |
0,310 |
||
|
G/G |
0,682 |
0,695 |
0,662 |
||
|
Статистика |
χ²=1,94; d.f.=2; p=0,38 |
χ²=0,48; d.f.=2; p=0,79 |
|||
|
A |
0,185 |
0,165 |
0,183 |
||
|
G |
0,815 |
0,835 |
0,817 |
||
|
Статистика |
χ²=0,53; d.f.=1; р=0,47 |
χ²=0,40; d.f.=1; р=0,53 |
|||
|
COL1A1 |
|||||
|
Sp1 (+1245 G/T) |
N=154 |
N=276 |
N=145 |
||
|
S/S (G/G) |
0,675 |
0,714 |
0,724 |
||
|
S/s (G/T) |
0,292 |
0,272 |
0,248 |
||
|
s/s (T/T) |
0,032 |
0,014 |
0,028 |
||
|
Статистика |
χ²=1,88; d.f.=2; p=0,39 |
χ²=1,07; d.f.=2; р=0,59 |
|||
|
S* |
0,821 |
0,850 |
0,848 |
||
|
s** |
0,179 |
0,150 |
0,152 |
||
|
Статистика |
χ²=1,17; d.f.=1; p=0,28 |
χ²=0,00; d.f.=1; p=0,96 |
|||
|
PCOL2 (-1997 G/T) |
N=154 |
N=268 |
N=145 |
||
|
G/G |
0,701 |
0,690 |
0,697 |
||
|
G/T |
0,253 |
0,280 |
0,262 |
||
|
T/T |
0,045 |
0,030 |
0,041 |
||
|
Статистика |
χ²=0,94; d.f.=2; р=0,62 |
χ²=0,48; d.f.=2; p=0,79 |
|||
|
G |
0,828 |
0,830 |
0,828 |
||
|
T |
0,172 |
0,170 |
0,172 |
||
|
Статистика |
χ²=0,01; d.f.=1; р=0,93 |
χ²=0,01; d.f.=1; р=0,92 |
|||
Примечание. d. f. – число степеней свободы, T* и S* – аллели, не имеющие сайта для рестриктазы, t** и s** – аллели, имеющие сайт для рестриктазы.
Носительство генотипа tt/GG гена VDR (+61968T>C, –3731А>G) встречалось в группе детей с врожденным сколиозом более чем в 2 раза чаще, чем в группе детей, не имеющих деформации позвоночника – соответственно у 11 % и 5,2 % случаев (χ²=4,17; d.f.=1; p=0,04). В группе детей с идиопатическим сколиозом этот генотип выявлен у 8,7 % больных. Кроме того, необходимо отметить, что не выявлено статистических различий в носительстве этого генотипа в группах пациентов с идиопатическим сколиозом и у детей без искривления позвоночного столба.
Сравнительный анализ распределения сочетания аллей и генотипов гена COLA1(+1245 G>T, –1997 G>T) в исследуемых группах пациентов показал, что генотипы ss/TT и ss/TG не встречались у пациентов, как имеющих сколиотическую деформацию позвоночника, так и в группе детей, не имеющих искривлений позвоночника. Кроме того, необходимо отметить, что не выявлено различий в распределении комбинаций аллей и генотипов COLA1 (+1245 G>T, –1997 G>T) в группах пациентов с врожденным сколиозом и детей, не имеющих деформацию позвоночника (χ²=3,08; d.f.=6; p>0,05), а также в группах пациентов с идиопатическим сколиозом и детей без сколиоза (χ²=1,07; d.f.=6; p>0,05). Анализ в группах пациентов с врожденным и идиопатическим сколиозом также не выявил различий в распределении комбинаций аллей и генотипов COLA1 (+1245 G>T, -1997 G>T) (χ²=1,92; d.f.=6; p>0,05).
Заключение
В ходе проведенного исследования установлено, что дети-носители аллеля «t(C)» и генотипа «tt(CC)» среди пациентов с врожденным сколиозом встречались достоверно чаще по сравнению со здоровыми детьми. Аналогичная тенденция отмечалась при генотипе tt/GG гена VDR в группе пациентов с врожденным сколиозом – она встречалась более чем в 2 раза чаще, чем в группе детей, не имеющих сколиотической деформации позвоночника.