Из многочисленных исследований известно, что многие регуляторные пептиды (РП) способны влиять на процессы гомеостаза, в том числе и свертывания крови [1, 6]. Среди РП известен ряд коротких глицин- и пролинсодержащих пептидов (глипролинов), являющихся фрагментами коллагена и эластина [2]. Было показано, что глипролины в условиях как in vitro, так и in vivo обладают антикоагулянтными свойствами, ускоряют фибринолиз, а также снижают адгезию и агрегацию тромбоцитов [6]. В настоящее время особое внимание уделяется изучению механизмов действия на гемостаз пептидов, имеющих в своем составе аминокислоту аргинин. По данным литературы известно, что аргинин усиливает антикоагулянтные свойства плазмы крови и препятствует процессам образования тромбов [10]. L-аргинин вырабатывает в организме оксид азота NO, который принимает участие в осуществлении некоторых физиологических функций – снижении агрегации тромбоцитов, вазодилатации, регуляции тонуса гладких мышц [7]. Ранее было показано антитромбоцитарное и антикоагулянтно-фибринолитическое действие пептидов Pro-Gly-Arg, Pro-Gly-Pro-Arg, Arg-Pro-Gly и Gly-Pro-Arg в условиях экспериментального аллоксанового диабета и гипергликемии у животных [5]. Известно, что изменение аминокислотной последовательности в структуре пептидов может приводить к значительным изменениям их свойств [8]. В связи с этим, в настоящее время большой интерес продолжают вызывать исследования, посвященные проблемам изучения эффектов глипролинов на гемостаз и взаимосвязи механизмов действия РП с их структурными особенностями.
Целью работы являлось изучение влияния на параметры гемостаза аргининсодержащих пептидов Pro-Arg-Gly и Gly-Arg-Pro в условиях in vitro и при их многократном интраназальном введении здоровым животным.
Материалы и методы исследования
В экспериментах использовали трипептиды Pro-Arg-Gly и Gly-Arg-Pro, синтезированные в лаборатории регуляторных пептидов Института молекулярной генетики РАН. Исследуемые пептиды растворяли в 0,85 % физиологическом растворе NaCl.
В условиях in vitro определяли антикоагулянтную активность исследуемых препаратов пептидов по тесту активированного частичного тромбопластинового времени (АЧТВ) общепринятым способом с использованием полуавтоматического анализатора АСКа-02 «Астра»; суммарную (СФА) и неферментативную (НФ) фибринолитическую активность препаратов определяли на пластинах нестабилизированного фибрина по методу Кудряшова и др. [4]. Антитромбоцитарное действие пептидов оценивали по изменению АДФ-индуцированной агрегации тромбоцитов в богатой тромбоцитами плазме крови по методу Борна с использованием в качестве индуктора раствор АДФ в конечной концентрации 2 мкМ [4]. При этом в образцы, содержащие 0,1 мл нормальной плазмы крыс, добавляли по 0,05 мл растворов пептидов в исследуемых концентрациях (от 10-5 до 1 мг/мл). Контролем служили образцы нормальной плазмы, к которой вместо исследуемых препаратов добавляли 0,89 % физиологический раствор NaCl.
Эксперименты in vivo были проведены на 30 белых крысах-самцах Wistar (250 ± 20 г). Животные содержались в стандартных условиях вивария (при искусственном освещении по 12 ч темного и светлого времени, принудительной вентиляции, температуре 20–23 °С и относительной влажности 60-70 %) при свободном доступе к пище и воде. Содержание и использование животных осуществляли с соблюдением принципов биоэтики в соответствии с международными принципами Европейской конвенции по защите позвоночных животных, используемых для экспериментальных и иных научных целей.
Производили интраназальное ежедневное (1 раз в сутки) в течение 5 дней введение препаратов пептидов Pro-Arg-Gly (1 группа) и Gly-Arg-Pro (2 группа) в дозах 1 мг/кг массы тела животного в объеме 0,02 мл. Контрольным животным (3 группа) интраназально вводили по 0,02 мл 0,85 % физиологического раствора NaCl. Кровь на исследование биохимических параметров гемостаза брали через 1 ч после последнего введения пептидов из вены jugularis в количестве 1,5 мл с использованием в качестве консерванта 3,8 % лимоннокислый натрий (9:1). Образцы крови центрифугировали при 1000g в течение 5 мин для получения богатой тромбоцитами плазмы, в которой измеряли агрегацию тромбоцитов (АТ) по Борну. Повторное центрифугирование образцов осуществляли при 3000g в течение 15 мин для получения плазмы, бедной тромбоцитами, в которой определяли антикоагулянтную активность по тесту АЧТВ, СФА и НФ на пластинах нестабилизированного фибрина, ферментативную фибринолитическую активность (ФФ) и активность тканевого активатора плазминогена (ААП) на пластинах стабилизированного фибрина [4].
Статистическую обработку результатов проводили с использованием t-критерия Стьюдента.
Результаты исследования и их обсуждение
В первой серии экспериментов пептиды Pro-Arg-Gly и Gly-Arg-Pro были исследованы на наличие антикоагулянтных, фибринолитических и антиагрегационных свойств в условиях in vitro.
Как видно из табл. 1, оба пептида при добавлении к плазме крови при всех исследуемых концентрациях обладали заметной антикоагулянтной активностью, т.е. замедляли время образования фибринового сгустка. По тесту АЧТВ отмечено достоверное удлинение времени свертывания плазмы при добавлении к пробам и Gly-Arg-Pro (на 37 – 89 % по сравнению с контролем), и пептида Pro-Arg-Gly (на 44 – 98 % по сравнению с контролем).
Таблица 1
Показатели гемостаза при действии пептидов Pro-Arg-Gly и Gly-Arg-Pro в условиях in vitro
|
Показатели гемостаза |
Препараты |
Концентрации пептидов, мг/мл |
|||
|
10-5 |
10-3 |
10-1 |
1 |
||
|
АЧТВ, с |
1. Pro-Arg-Gly |
39.3 ± 0.446 ** |
37.0 ± 2.07** |
32.3 ± 0.74* |
31.7 ± 1.6 |
|
2. Gly-Arg-Pro |
39.3 ± 0.4 ** |
31.7 ± 3.69* |
31.9 ± 1.02** |
29.4 ± 2.66* |
|
|
3. Контроль |
20.8 ± 0.92 |
18.6 ± 0.9 |
22.4 ± 1.01 |
21.5 ± 1.05 |
|
|
СФА, мм2 |
1. Pro-Arg-Gly |
50 ± 4.5* |
26.25 ± 4.32 |
30.5 ± 3.05* |
39.5 ± 3.9* |
|
2. Gly-Arg-Pro |
36 ± 1.0** |
31.75 ± 4.9 |
30 ± 1.2** |
27.75 ± 3.1 |
|
|
3. Контроль |
22.5 ± 1,21 |
25 ± 1.12 |
20 ± 0.9 |
22.5 ± 0.95 |
|
|
НФ, мм2 |
1. Pro-Arg-Gly |
28,5 ± 1.72** |
12 ± 1.2* |
27 ± 1.14** |
30 ± 1.4** |
|
2. Gly-Arg-Pro |
23.75 ± 4.0* |
23.75 ± 1.44 |
30.12 ± 0.14** |
25 ± 1.1** |
|
|
3. Контроль |
14 ± 1.1 |
20.5 ± 2.06 |
16 ± 0.8 |
17.5 ± 0.9 |
|
|
Агрегация тромбоцитов, % |
1. Pro-Arg-Gly |
18.3 ± 0.34 |
17.5 ± 0.35* |
18.4 ± 0.42 |
18.6 ± 0.46* |
|
2. Gly-Arg-Pro |
20.3 ± 0.34 |
19.6 ± 0.46 |
20.0 ± 0.46 |
18.2 ± 0.40* |
|
|
3. Контроль |
19.0 ± 0.4 |
20.4 ± 0.5 |
19.8 ± 0.9 |
20.6 ± 0.38 |
|
Примечание: *p < 0,05; **p < 0,01 – различия достоверны по сравнению с контролем (группа 3).
Изучение влияния пептидов на фибринолитическую активность плазмы крови показало, что добавление пептида Pro-Arg-Gly приводило к достоверному повышению СФА на 53 – 122 % по сравнению с контролем во всем исследуемом диапазоне концентраций (табл. 1). Наряду с этим, при всех концентрациях от 10-5 до 1 мг/мл данный пептид обладал неферментативной фибринолитической активностью, которая возрастала на 69 – 103 % по сравнению с контролем.
При этих условиях добавление пептида Gly-Arg-Pro в концентрациях 1 мг/мл и 10-3 мг/мл к плазме крови приводило к достоверному повышению СФА на 60 и 50 % соответственно по сравнению с контролем за счет увеличения НФ на 43 – 70 %.
Исследование влияния Pro-Arg-Gly и Gly-Arg-Pro на агрегацию тромбоцитов показало уменьшение этого показателя на 10 и 14 % при концентрациях Pro-Arg-Gly 10-3 и 1 мг/мл соответственно, а для Gly-Arg-Pro – на 12 % по сравнению с контрольными образцами только при концентрации 1 мг/мл (табл. 1).
Во второй серии экспериментов исследовали действие Pro-Arg-Gly и Gly-Arg-Pro при их многократном интраназальном введении здоровым животным.
Как видно из табл. 2, введение Pro-Arg-Gly вызывало повышение антикоагулянтного фона плазмы крови животных группы 1, поскольку время образования сгустка по тесту АЧТВ достоверно удлинялось на 22 % относительно контрольных значений. При введении Gly-Arg-Pro достоверных отличий изменения времени свертывания по сравнению с контрольными значениями не выявлено.
Таблица 2
Показатели гемостаза через 1 ч после 5-кратного интраназального введения пептидов Pro-Arg-Gly и Gly-Arg-Pro в дозах 1 мг/кг здоровым животным
|
Группы животных |
АЧТВ, с |
СФА, мм2 |
НФ, мм2 |
ФФ, мм2 |
ААП, мм2 |
АТ, % |
|
Группа 1 Pro-Arg-Gly (n = 10) |
32.3 ± 1.24** |
122.4 ± 6.15** |
87.5 ± 2.02 |
31.8 ± 6.19* |
34.25 ± 6.01** |
11.8 ± 0.78** |
|
Группа 2 Gly-Arg-Pro (n = 10) |
27.8 ± 1.02 |
100.4 ± 2.23 |
88.9 ± 2.75 |
11.7 ± 3.59 |
16.8 ± 2.79* |
18.9 ± 0.92** |
|
Группа 3 NaCl (контроль) (n = 10) |
26.5 ± 0.43 |
97 ± 3.17 |
78.1 ± 4.83 |
17.2 ± 2.37 |
9.15 ± 1.11 |
24.4 ± 0.90 |
Примечание: *p < 0,05; **p < 0,01 – различия достоверны по сравнению с контролем (группа 3), n – количество животных в каждой группе.
Наряду с этим, Pro-Arg-Gly вызывал изменение показателей фибринолитической системы плазмы крови экспериментальных животных: увеличение СФА на 26 % по сравнению с контролем происходило главным образом за счет возрастания ферментативной фибринолитической активности плазмы (на 85 % по сравнению с контролем), обусловленного значительным (в 3,74 раза относительно контрольных значений) усилением активности тканевого активатора плазминогена (табл. 2).
Введение пептида Gly-Arg-Pro приводило к достоверному повышению только ААП в 1,84 раза по сравнению с контролем. При этом достоверного изменения показателей СФА и ФФ не было выявлено.
Следует отметить, что введение и Pro-Arg-Gly, и Gly-Arg-Pro вызывало повышение неферментативной фибринолитической активности плазмы крови животных, но эти отличия от контрольных значений носили недостоверный характер.
В то же самое время введение и Pro-Arg-Gly, и Gly-Arg-Pro приводило к усилению антитромбоцитарных свойств плазмы крови животных. Так, после многократного применения пептида Gly-Arg-Pro в крови животных группы 2 наблюдали достоверное снижение агрегации тромбоцитов на 27 % по сравнению с контрольными значениями. Введение пептида Pro-Arg-Gly приводило к более выраженному снижению агрегации тромбоцитов (на 52 % по сравнению с контролем).
Заключение
Делая сравнительной анализ влияния исследованных пептидов на показатели гемостаза, можно отметить, что пептиды Pro-Arg-Gly и Gly-Arg-Pro при их многократном интраназальном введении здоровым животным влияли на состояние свертывающей и противосвертывающей систем крови в разной степени: Pro-Arg-Gly вызывал умеренное увеличение антикоагулянтной активности, повышал фибринолитический потенциал плазмы крови за счет усиления ФФ, которое было обусловлено эндотелий-зависимой реакцией выброса в кровоток тканевого активатора плазминогена и возрастанием ААП; пептид Gly-Arg-Pro усиливал только активность ААП. Вероятно, это действие исследуемых пептидов неспецифично, так как и другие глипролины ингибируют свертывание крови при интраназальном применении [6].
Помимо этого, применение обоих пептидов приводило к снижению агрегации тромбоцитов, и более сильный антитромбоцитарный эффект был у Pro-Arg-Gly. Снижение агрегации тромбоцитов под действием исследованных нами пептидов может быть обусловлено их взаимодействием с рецепторами тромбоцитов, в том числе гликопротеином IIb-IIIa, с последующим блокированием этих рецепторов [3]. Также по данным Hasan et al. [9] пептиды, содержащие аминокислоту аргинин, ингибируют активность тромбина, что в итоге приводит к антикоагулянтному действию этих пептидов.
Таким образом, трипептиды Pro-Arg-Gly и Gly-Arg-Pro при исследовании in vitro и при введении в организм здоровых животных проявляли выраженные в разной степени антикоагулянтные, фибринолитические и антитромбоцитарные свойства. При этом пептид Pro-Arg-Gly обладал более сильным противосвертывающим действием. Следовательно, полученные нами результаты позволяют предположить, что применение аргининсодержащих коротких регуляторных пептидов может быть перспективно при гиперкоагуляционных нарушениях в системе гемостаза, сопровождающих многочисленные патологии организма.