Scientific journal

International Journal of Applied and fundamental research

ISSN 1996-3955

ИФ РИНЦ = 0,593

Для исследования биологически активных веществ (БАВ), одним из наиболее удобных и быстрых методов является методика органотипического культивирования различных тканей [9, 10]. С применением этой методики был исследован ряд биорегуляторных пептидов, не обладающих видоспецифичностью, в но в то же время являющихся тканеспецифичными [6, 7]. Биорегуляторные пептиды в настоящее время уже используются в медицинской практике при многих заболеваниях нервной, иммунной, эндокринной систем, при патологии различных органов [3, 9]. Одним из научно обоснованных методов повышения продолжительности и качества жизни также является применение пептидных биорегуляторов. Пептидные биорегуляторные препараты в течение 1980–2015 гг. получили более 15 млн человек с различной патологией или в качестве средств профилактики, и в рандомизированном сравнительном исследовании установлено снижение темпа старения организма и смертности [9].

В настоящее время фармацевтическая компания ООО «Самсон-Мед» производит субстанцию и лекарственный препарат «Сампрост® лиофилизат для приготовления раствора для внутримышечного введения 5 мг», который представляет собой комплекс биологически активных пептидов предстательной железы, а ФГУП «НПО «Микроген» производит лекарственный препарат «Простакор раствор для внутримышечного введения, 5 мг/мл». Препараты получают из предстательной железы крупного рогатого скота и используют для лечения простатита. «Тималин лиофилизат для приготовления раствора для внутримышечного введения» производства ООО «Самсон-Мед» и «Тактивин® раствор для подкожного введения 0,1 мг/мл» производства АО «Биомед» им. И.И. Мечникова являются иммуномодулирующими препаратами, их получают из тканей тимуса (вилочковой железы) крупного рогатого скота. Актуальной является проблема быстрого тестирования биологической активности и специфичности действия этих препаратов. Метод реактивации щелочной фосфатазы, ингибированной цистеином, а также метод «активного розеткообразования» тимоцитов морской свинки с эритроцитами кролика отражают каждый только один из многих биохимических процессов в организме. В то же время органотипическое культивирование сразу показывает воздействие пептидов на основные клеточные процессы – пролиферацию или апоптоз (программированная клеточная гибель) в соответствующей ткани. Т.е. при культивировании максимально воспроизводятся те условия, которые происходят в тканях организма под действием биорегуляторных пептидов, с учетом усиления клеточной регенерации. Таким образом, наиболее адекватным методом для быстрой количественной оценки направленности влияния исследуемых БАВ является органотипическое культивирование фрагментов тканей [1, 2, 7, 8]. Этот быстрый (в течение 3 суток) скрининговый метод позволяет проанализировать усиление или угнетение клеточной регенерации при воздействии того или иного биологически активного вещества, а также лекарственного препарата. К преимуществам этого метода относится также то, что в фрагментах культивируемой ткани сохраняется ее структурная организация.

Целью работы было исследование биологической активности и специфичности действия вышеуказанных препаратов с использованием метода органотипического культивирования различных тканей крыс.

Материалы и методы исследования

В опытах органотипического культивирования использованы половозрелые крысы линии Вистар, массой 250–300 г. Фрагменты селезенки либо предстательной железы самцов крыс величиной 1 мм3 размещались в чашках Петри (с полилизиновым покрытием дна). В питательную среду добавляли по 35 % среды Игла и раствора Хенкса, а также фетальную сыворотку быка, глюкозу (0,6 %), гентамицин (100ед/мл). Для определения эффективных концентраций лекарственные препараты добавляли в питательную среду экспериментальных чашек Петри в концентрациях 1–50 нг/мл. Эксплантаты тканей в чашках Петри культивировались в термостате с подачей 5 % СО2. при температуре 37 °С. В 1-е сутки культивирования происходило выселение пролиферирующих и мигрирующих клеток, образующих зону роста эксплантата. Оценку влияния препаратов на развитие эксплантатов производили морфометрическим методом, используя критерий индекса площади (ИП). ИП являлся отношение площади всего эксплантата, вместе с периферической зоной роста, к площади центральной зоны. В каждой чашке Петри считали ИП у каждого из 15–18 эксплантатов, складывали значения и делили на число эксплантатов, т.е. получали средний ИП для данной чашки. Контрольное значение ИП принимали за 100 %, все остальные ИП выражали в процентах к контролю. Достоверность различий сравниваемых средних значений ИП контрольных и опытных образцов оценивали с помощью t-критерия Стьюдента. Статистическую обработку полученных данных производили с использованием пакета программ «Microsoft Excel».

Результаты исследования и их обсуждение

В табл. 1 представлены результаты тестирования влияния ряда биорегуляторных пептидов, выделенных из предстательной железы крупного рогатого скота, на увеличение индекса площади ( %) эксплантатов предстательной железы линейных крыс Вистар. Так при культивировании фрагментов ткани выявлено, что лекарственный препарат «Сампрост® лиофилизат» серии 10214 в концентрациях 20 и 50 нг/мл приводил к статистически достоверному увеличению ИП эксплантатов на 22 ± 3 % (n = 21, p < 0,05) и на 47 ± 5 % (n = 19, p < 0,05) соответственно, по сравнению с ИП контрольных эксплантатов (n = 18). Препарат «Простакор®» приводил к статистически достоверному увеличению ИП эксплантатов на 20 ± 3 % (n = 20, p < 0,05), по сравнению с ИП контрольных эксплантатов (n = 19) только при концентрации 50 нг/мл. Таким образом, препарат Сампрост обладал более широким диапазоном действия, эффективно стимулируя зону роста предстательной железы при концентрациях 20 и 50 нг/мл.

Аналогичным образом подтверждено тканеспецифическое действие остальных исследованных биорегуляторных пептидов в отношении тканей предстательной железы и селезенки. Таким образом, используемый для идентификации и характеристики биорегуляторных пептидов скрининговый метод органотипического культивирования тканей относительно прост и позволяет быстро получить экспериментальные данные, необходимые для статистической обработки. Можно полагать, что метод органотипического культивирования тканей для определения активности биорегуляторных пептидов имеет ряд преимуществ по сравнению с такими методами, как реакция «активного» розеткообразования (РОК) для исследования препаратов из тимуса или реактивация щелочной фосфатазы, ингибированной цистеином, для исследования препаратов из предстательной железы. Указанные методы представляют многоступенчатые трудоемкие исследования с использованием большого количества химических реактивов. Для метода РОК требуется значительное количество дорогостоящих животных – морских свинок. Данные, полученные в настоящей работе методом органотипического культивирования тканей свидетельствуют о биологической активности и специфичности действия препаратов «Сампрост®», «Простакор®», «Тималин», «Тактивин®». Биологическая активность биорегуляторных пептидов может быть объяснена на молекулярном уровне следующим образом [7, 8]. Олигопептиды способны проникать в клетку через цитоплазму и мембрану ядра [5]. Комплементарное взаимодействие этих пептидов с промоторными зонами генов является сигналом для транскрипции, трансляции и синтеза белков на рибосомах. Цепь этих процессов приводит к повышению функций различных органов и увеличивает ресурс организма.

Заключение

Полученные в данной работе результаты показывают, что использование органотипической культуры ткани, представляющей сравнительно простую модельную систему, позволяет быстро тестировать биологическую активность и специфичность действия биорегуляторных пептидов. Это в свою очередь способствует успешному решению многих проблем фармакологии в области биорегуляторных пептидов.