В почвоведении известен факт прямого участия всех микробиотических представителей как в первичной деструкции почвообразующих пород, так и в формировании профиля почвенного тела [3, 8]. Однако в практике почвенной микробиологии, к сожалению, пока недостаточно сведений о прямом участии некоторых родов почвообитающих микроорганизмов в деградации веществ, используемых в качестве удобрений и почвенных кондиционеров [2, 6, 7]. В том числе данный пробел имеется и в отношении эффектов от прямого (без участия собственно почвенного вещества) биохимического воздействия силикатных бактерий, выделенных из конкретных природных биогеоценозов, на вещество высококремнистых пород – диатомита, цеолита и бентонитовой глины [5].
Цель исследования. Целью исследования настоящей работы явилось изучение динамики численности живых клеток накопительной природной культуры силикатных бактерий, а также чистой культуры Bacillus Mucilaginosus, выделенных из дерново-подзолистой легкосуглинистой почвы Нижегородской области, в условиях осуществления биохимической деградации вещества природных кремнийсодержащих пород, которые используются в наших полевых исследованиях в качестве удобрений и почвенных кондиционеров.
Материалы и методы исследования
Исследования проводились в 2017 году на базе научно-образовательного центра «Биотехнология» и лабораторного комплекса «Эколого-аналитическая лаборатория мониторинга и защиты окружающей среды» Мининского университета в виде серии постановочных лабораторных экспериментов с природными кремнийсодержащими породами. Данные материалы подвергались микробиологической деградации чистой культурой Bacillus Mucilaginosus и накопительной культурой комплекса силикатных бактерий, выделенных из дерново-подзолистой легкосуглинистой почвы природного биогеоценоза (лесной массив Борского района Нижегородской области).
Объектами исследований являются кремнийсодержащие породы – диатомит Инзенского месторождения (Ульяновская область), цеолит Хотынецкого месторождения (Орловская область) и бентонитовая глина Зырянского месторождения (Курганская область), обобщенный химический состав которых представлен в таблице.
Накопительную культуру комплекса силикатных бактерий получали путем засева стерильного жидкого варианта питательного агара Александрова-Зака (ААЗ) навеской подготовленной почвы с последующим культивированием бактериальной биомассы в термостате в течение 7 суток при температуре +26?С. Чистую природную культуру Bac. Mucilaginosus получали аналогичным способом в виде двойного пересева идентифицированных клеток на селективном жидком варианте питательного агара Няниковой-Виноградова (АНВ) [10].
Обобщенный химический состав высококремнистых пород
|
Порода |
ИЕ* |
Элемент в оксидной форме (на абс.-сух. вещество) |
||||
|
SiO2 |
P2O5 |
K2O |
CaO |
MgO |
||
|
Диатомит |
80 |
|||||
|
- валовая форма, % |
83,1 |
0,05 |
1,25 |
0,52 |
0,48 |
|
|
- подвижная форма, мг/кг |
12200 |
37 |
350 |
10 |
39 |
|
|
Цеолит |
48 |
|||||
|
- валовая форма, % |
56,6 |
0,23 |
1,82 |
13,3 |
1,90 |
|
|
- подвижная форма, мг/кг |
7950 |
260 |
250 |
4800 |
1600 |
|
|
Бентонит |
150 |
|||||
|
- валовая форма, % |
52,3 |
0,12 |
0,92 |
5,5 |
3,2 |
|
|
- подвижная форма, мг/кг |
10500 |
165 |
87 |
46,1 |
14,2 |
|
* – ионообменная емкость, мг-экв./100 г
Для сравнения жизнеспособной численности природной клетки Bac. Mucilaginosus использовали условный эталон – аналогичную бактерию штамма В-2609, лиофилизат которого был закуплен во Всероссийской коллекции промышленных микроорганизмов (ФГУП «ГосНИИгенетика»). Первичная биомасса данного штамма была получена аналогичным с природными клетками образом при его двукратном культивировании на L-агаре (АЛ) в соответствии с рекомендациями изготовителя.
Затем производился засев испытуемых пород полученными бактериальными комплексами. Опыты ставили в стерильных конических колбах на 100 мл, в которые асептически помещалось по 40 мл селективной жидкой питательной среды и точно по 1,000 г высушенной кремнийсодержащей породы, после чего полученная система асептически засевалась 10 мл суспензии 7-суточной накопительной культуры силикатных бактерий, а также чистой культуры природного и штаммового вариантов Bac. Mucilaginosus [1, 4].
Засеянные колбы помещались в термостат и культивировались при +26?С в течение 30 суток; 2 раза в сутки содержимое колб встряхивалось в течение 1-го часа. Через определенные интервалы времени (на 1, 3, 5, 7, 10, 12, 15, 20, 25 и 30 день) производилось определение численности живых клеток бактерий люминесцентной микроскопией с акридином оранжевым [9] с помощью микроскопа «БиоТех-330–LED2–Tr».
Математическая обработка результатов исследований выполнена методами вариационной статистики с использованием программного обеспечения Microsoft Office Excel 2007; повторность в опытах четырехкратная.
Результаты исследования и их обсуждение
На рис. 1 представлена 30-дневная динамика численности живых клеток чистой природной культуры Bacillus Mucilaginosus и штамма В-2609, принятого за условный эталон, в системе «диатомит-культура».
Рис. 1. Динамика численности живых клеток чистой почвенной культуры (АНВ) и штамма В-2609 (АЛ) Bacillus Mucilaginosus при биохимической деградации диатомита Инзенского месторождения
Нужно сказать, что численность клеток Bac. Mucilaginosus обоих рассматриваемых вариантов увеличивалась достаточно плавно к 15-му дню культивирования, где составила 17,80?106 клеток/1 мл по почвенной культуре и 19,69?106 клеток/1 мл по эталонному штамму В-2609. В течение всей экспозиции эксперимента с диатомитом численность штаммовых клеток была стабильно выше количества природного аналога.
Данные рис. 2 отражают 30-дневную динамику численности живых клеток чистой природной культуры Bacillus Mucilaginosus и штамма В-2609, принятого за условный эталон, в системе «цеолит-культура».
При бактериальной деструкции цеолита численность почвенной культуры Bac. Mucilaginosus увеличивалась не с такой интенсивностью, как на варианте с диатомитом. Здесь наибольшее количество живых клеток было отмечено на 10-й и 12-й дни эксперимента – 7,82?106 и 5,19?106 клеток/1 мл. Количество клеток штамма В-2609 аналогичным образом увеличивалось к 10-му дню, где составило 7,82?106 клеток/1 мл. На 15-й и 20-й дни численность была практически неизменна (плато в 3,99–3,83?106 клеток/1 мл), далее резко шел спад жизнеспособности культуры.
На рис. 3 показана 30-дневная динамика численности живых клеток чистой природной культуры Bacillus Mucilaginosus и штамма В-2609, принятого за условный эталон, в системе «бентонит-культура».
Рис. 2. Динамика численности живых клеток чистой почвенной культуры (АНВ) и штамма В-2609 (АЛ) Bacillus Mucilaginosus при биохимической деградации цеолита Хотынецкого месторождения
Рис. 3. Динамика численности живых клеток чистой почвенной культуры (АНВ) и штамма В-2609 (АЛ) Bacillus Mucilaginosus при биохимической деградации бентонита Зырянского месторождения
Из всех изучаемых пород вариант с бентонитовой глиной оказался самым многочисленным по количеству клеток бактерий Bac. Mucilaginosus. Кроме того, на данном варианте максимальный пик численности бацилл пришелся уже на 7-й день как по почвенной культуре, так и по штамму. В частности, по природной культуре данная численность составила 32,84?106 клеток/1 мл, в то время как по штамму В-2609 – 66,10?106 клеток/1 мл. В последующие дни экспозиции эксперимента с бентонитом жизнеспособность бацилл стабильно снижалась.
Данные рис. 4 показывают 30-дневную динамику численности живых клеток накопительной природной культуры комплекса силикатных бактерий в системе «порода-культура» с различными кремнийсодержащими материалами.
Рис. 4. Динамика численности живых клеток накопительной почвенной культуры комплекса силикатных бактерий при биохимической деградации кремнийсодержащих пород
В отличие от обеих изучаемых культур Bac. Mucilaginosus, численность накопительной культуры комплекса силикатных бактерий, полученная на агаре Александрова-Зака, по-иному изменялась в зависимости от той или иной кремнийсодержащей породы. Так, на варианте с диатомитом пик численности клеток пришелся на 15-й день и составил 320,4?106 клеток/1 мл. На варианте с цеолитом в это же время численность составила 476,3?106 клеток/1 мл. Однако на варианте с бентонитовой глиной пик максимального числа пришелся много раньше – на 5-й день (273,3?106 клеток/1 мл), после чего показатель снижался до плато, пришедшегося на 12-й и 15-й дни (183,9–176,1?106 клеток/1 мл), а затем спадал до уровня численности бактерий остальных вариантов исследования.
Заключение
В условиях лабораторных экспериментов было изучено 30-дневное изменение численности живых микробных клеток чистой культуры Bacillus Mucilaginosus, а также накопительной культуры природного комплекса силикатных бактерий, происходящее при биохимической деградации природных кремнийсодержащих пород – диатомита, цеолита и бентонитовой глины. Бактерии были выделены из дерново-подзолистой легкосуглинистой почвы Нижегородской области. Для сравнения использовался штамм В-2609 бациллы Bac. Mucilaginosus. Было выявлено, что численность Bac. Mucilaginosus имела максимальное увеличение при деструкции бентонитовой глины (до 66,10?106 клеток/1 мл), оказалась на среднем уровне при деструкции диатомита (17,80?106 клеток/1 мл) и была минимальной при деградации цеолита (до 2,13?106 клеток/1 мл). Штаммовый вариант изучаемой бациллы давал аналогичные, но более высокочисленные тенденции по породам. Накопительная культура природного комплекса почвенных силикатных бактерий давала максимальную численность на варианте с цеолитовой породой (до 476,3?106 клеток/1 мл), среднюю – на варианте с диатомитом (до 320,4?106 клеток/1 мл) и минимальную – на варианте с бентонитовой глиной (до 273,3?106 клеток/1 мл).