Scientific journal
International Journal of Applied and fundamental research
ISSN 1996-3955
ИФ РИНЦ = 0,564

THE BREAKING OF RESISTANCE TO GENTAMYCIN IN METHICILLIN RESISTANT STAPHYLOCOCCUS AUREUS STRAINS

Bozhkova S.A. 1 Polyakova E.M. 1 Krasnova M.V. 1
1 Vreden Russian Research Institute of Traumatology and Orthopedics of Minzdrav of Russia
2105 KB
The increasing of the bacterial antibiotic resistance dictates the need for searching of new approaches for the treatment efficacy improvement in patients with infections caused by the resistant pathogens. One of the such approaches is the search of effective combinations of the known different class antibiotics, having of synergistic action. Aim of this study is to evaluate of in vitro combination activity of gentamycin and dioxydin, having different mechanism of antibacterial action to methicillin resistant strains. The chessboard method and the death growth curve models in presence of antibiotics were applied. S. aureus АТСС 25923 and АТСС 6538 strains, and also two gentamycin resistant MRSA strains, isolated from patients with surgical site infection after the hip joint replacement. The extremely low dioxydin activity both to methicillin resistant strains (156 mcg/ml), and methicillin sensitive strains (39 mcg/ml) was detected. The gentamycin MIC for the tested MRSA strains was four time higher than MIC for MSSA strains. However gentamycin and dioxydin MICs were substantially lower in case of the using of these antibiotics in combination with each other. The synergistic effect of the gentamycin and the dioxydin on all tested S. aureus strains was supported by the death growth curve method. Thus, the gentamycin effect by means of the dioxydin using provides of the potentiation of bactericidal effect on the methicillin resistant S. aureus strains. It allows to consider a possibility of using of the provided combination for the treatment of the infections caused by multiresistant staphylococci.
staphylococcal infection
gentamycin
dioxydin
endoprosthesis replacement

В связи с повсеместным ростом резистентности микробных возбудителей к антибактериальным препаратам во всех областях медицины возрастает актуальность поиска путей повышения эффективности лечения пациентов с инфекциями, обусловленными устойчивыми штаммами патогенов. Создание новых антибактериальных препаратов, с одной стороны, имеет долговременный характер и требует значительных финансовых затрат, с другой – к сожалению, не всегда является эффективным способом борьбы с резистентными возбудителями, пластичность которых, а также их способность к выживанию практически безграничны. Это определяет необходимость искать новые подходы к решению данной проблемы, одним из которых является поиск эффективных комбинаций уже известных лекарственных средств разных классов, обладающих синергидным действием. Такие комбинации обеспечивают бактерицидное действие и эффективное подавление гнойной инфекции, вызываемой, «трудными микроорганизмами», в частности метициллинорезистентными стафилококками. Из известных в настоящее время более 30 видов стафилококков основное клиническое значение имеют Staphylococcus aureus и Staphylococcus epidermidis.

Наиболее трудными для лечения являются инфекции, вызванные метициллинорезистентными штаммами S. aureus (MRSA) и S. epidermidis (MRSE), в частности инфекции области хирургического вмешательства после больших ортопедических операций. Распространенность штаммов MRSA в России высока. Несмотря на то, что по данным многоцентрового исследования в структуре бактериальных возбудителей нозокомиальных инфекций за 2011–2012 гг. доля S. aureus составила 16,7 %, что сопоставимо с данными 2006–2008 гг. (19,5 %), существенно увеличилась значимость метициллинорезистентных штаммов данного возбудителя. Доля MRSA составляла 33,4 % в 2001–2002 гг. и 55,4 % в 2006–2008 гг., возросла до 66,9 % к 2011–2012 гг. [5]. Выделение метициллинорезистентных штаммов S. aureus и S. epidermidis из гнойного очага при перипротезной инфекции является неблагоприятным прогностическим признаком для эффективности антибактериальной терапии и лечения в целом. В РФ до настоящего времени препаратом выбора при MRSA- и MRSE-ассоциированных инфекциях остаётся гликопептидный антибиотик ванкомицин. Однако в настоящее время в научной медицинской литературе многие авторы отмечают снижение эффективности ванкомицина при антибактериальной терапии инфекций, вызванных метициллинорезистентными стафилококками, in vitro демонстрирующими чувствительность к ванкомицину [9]. Это определяет необходимость применения эффективных комбинаций уже известных лекарственных средств разных классов, обладающих синергидным действием в отношении лекарственноустойчивых микробных возбудителей. К примеру, сохранившие активность рифампицин и фузидиевую кислоту для достижения хорошего антистафилококкового эффекта необходимо сочетать c β-лактамами или фторхинолонами [8]. Многие зарубежные исследователи предлагают широко использовать комбинированную антибактериальную терапию при лечении инфекции протезированного сустава стафилококковой этиологии для усиления бактерицидного эффекта, воздействия на микробные биопленки и на клетки бактерий, расположенные внутриклеточно [8].

Целью настоящего исследования было оценить in vitro активность комбинации гентамицина и диоксидина, обладающих принципиально различным механизмом антимикробного действия, в отношении штаммов метициллинорезистентных стафилококков.

Материалы и методы исследования

Для выяснения характера взаимодействия гентамицина и диоксидина в комбинации применяли последовательно два метода: «шахматной доски» и конструирования кривых гибели/роста тест-культуры при воздействии антимикробных агентов

Для метода «шахматной доски» в качестве тест-культур использовали 2 референс-штамма S. aureus АТСС 25923 и S. aureus АТСС 6538, а также 2 клинических изолята стафилококков, резистентных к гентамицину: штаммы MRSA 8074 и 8785, выделенные стандартными методами от пациентов с документированной инфекцией области хирургического вмешательства после эндопротезирования тазобедренного сустава. Все исследования проводили с троекратным повторением на стандартных 96-луночных микропланшетах. Для оценки взаимодействия антибиотиков рассчитывали фракционный индекс ингибиции (FIX – the fractional inhibitory index) по формуле

FIX = FIC (одного антибиотика) + + FIC (второго антибиотика),

где FIC (fractional inhibitory concentrations) – фракционная ингибирующая концентрация исследуемого антибиотика, определяемая как отношение величины минимальной подавляющей концентрации (МПК) этого антибиотика в комбинации с МПК второго антибиотика. Характера взаимодействия препаратов определяли по величине коэффициента FIX согласно шкале: < 0,5 синергизм 0,5–4 индифферентность > 4 антагонизм.

Технически метод осуществляли следующим образом: в каждую лунку 96-луночного планшета вносили по 50 мкл питательного бульона Мюллера-Хинтон (МХБ). Антимикробные препараты титровали серийно двукратно: гентамицин с концентрации 2400 до 0 мкг/мл (ряды A-H), диоксидин – с 2500 до 0 мкг/мл (колонки 1–12) (рис. 1).

Инокулюм каждой тест-культуры (0,5 McFarland) готовили в стерильном изотоническом растворе. В каждую лунку вносили по 100 мкл инокулюма и инкубировали планшет 18 ч при 37 °C. За МПК (в мкг/мл) принимали наименьшую концентрацию антимикробного средства, при которой не наблюдалось видимого роста микроорганизма. Далее для тестируемых штаммов S. aureus рассчитывали коэффициенты FIX. На основе значений фракционных коэффициентов FIC строили изоболограмму и оценивали ее характер.

Метод кинетических кривых гибели/роста бактерий заключался в построении зависимости гибели тестируемых штаммов стафилококков под действием гентамицина и диоксидина индивидуально и в комбинации. Готовили инокулюм (0,5 McFarland) с последующим разведением до концентрации 105 КОЕ/мл в 10 мл среды МХБ, содержащей соответствующую концентрацию антимикробных средств: 1×МПК и 1/4×МПК. В данном эксперименте использовали значения МПК каждого препарата, установленные методом «шахматной доски» для эффективного подавления культуры возбудителя комбинацией гентамицина и диоксидина. Антимикробные комбинации изучаемых препаратов составляли из концентраций, соответствующих 1×МПК+1×МПК и 1×МПК+1/4×МПК каждого агента. Динамику роста тест-культур в МХБ без антибиотика использовали для определения контрольных значений КОЕ/мл. Пробирки инкубировали при 37 °C. Отбор проб осуществляли на 0 ч, 2 ч и 6 ч, стандартным способом производили количественные высевы на чашки агаром Мюллера-Хинтон (МХА) с последующей инкубацией 18–24 ч. Подсчитывали число КОЕ на чашках. Данные выражали в виде Lg от числа выживших колониеобразующих единиц (LgКОЕ/мл). Результаты подсчета КОЕ в точках 0 ч и 24 ч использовали для оценки взаимодействия препаратов. Синергизм определяли как снижение величины КОЕ в 100 или более раз (на 2 Lg) через 24 ч в комбинации, при сравнении с индивидуальным наиболее активным антимикробным препаратом и как 100-кратное снижение КОЕ в сравнении с начальным инокулюмом. Потенцирование (аддитивность), или индифферентность, определяли как менее чем 10-кратное изменение в числе КОЕ на 24 ч при действии комбинации по сравнению с КОЕ при индивидуальном действии наиболее активного антимикробного препарата. Антагонизм определяли при возрастании числа КОЕ в 100 и более раз через 24 ч при действии комбинации в сравнении с наиболее активным индивидуальным препаратом.

Количественные результаты представлены в виде медиан, в качестве меры рассеивания использовали межквартильный интервал 25–75 % (МКИ 25–75 %).

Результаты исследования и их обсуждение

Установленные по результатам 3-х экспериментов медианы МПК (табл. 1) показали крайне невысокую активность диоксидина при воздействии как на штаммы устойчивые к метициллину (156 мкг/мл), так и чувствительные (39 мкг/мл). Кроме того, МПК гентамицина в отношении тестируемых изолятов MRSA также в 4 раза превысила МПК для чувствительных к метициллину референс-штаммов. Однако применение антимикробных препаратов в комбинации потребовало существенно меньших их концентраций для эффективного подавления возбудителей.

Медианы коэффициентов FIC и FIX взаимодействия гентамицина и диоксидина свидетельствуют (табл. 2) об эффективном действии изучаемой комбинации в отношении всех тестируемых культур стафилококков. Величина итоговых коэффициентов FIX во всех случаях не превысила 0,5 и составила для всех штаммов 0,09–0,26, что характерно для синергидного действия препаратов. Установлено, что, несмотря на выявленное синергидное действие в отношении метициллинорезистентных изолятов стафилококков устойчивых к гентамицину, коэффициент FIX для них был выше, чем для референс-штаммов, чувствительных к метициллину и гентамицину.

bogk1.tif

Рис. 1. Схема 96-луночного микропланшета для оценки эффекта комбинации двух антимикробных препаратов методом «шахматной доски» в отношении культуры клинического штамма MRSA 8074, резистентного к гентамицину. Примечание: «+» – рост тест-культуры в лунке; «-» – отсутствие видимого роста в лунке

Таблица 1

МПК исследуемых препаратов при индивидуальном и комбинированном воздействии на тестируемые штаммы (метод «шахматной доски»)

Штаммы

Гентамицин

Ме (МИК 25–75 %)

Диоксидин

Ме (МИК 25–75 %)

МПК

МПК в комбинации

МПК

МПК в комбинации

MRSA 8074

4,8

1,2

156

2,44

MRSA 8785

4,8

1,2

156

1,22

S. aureus АТСС 25923

0,029

(0,022–0,029)

0,0009

(0,0007–0,0009)

39

2,44

S. aureus АТСС 6538

0,015

0,0009

(0,0009–0,0023)

39

2,44

(1,525–2,44)

Таблица 2

Результаты исследования взаимодействия гентамицина и диоксидина (метод «шахматной доски»)

Тест-штаммы

FIC гентамицин

Me (МКИ 25–75 %)

FIC диоксидин

Me (МКИ 25–75 %)

FIX

Me (МКИ 25–75 %)

MRSA 8074

0,25 (0,25–0,25)

0,007 (0,007–0,0115)

0,26 (0,26–0,265)

MRSA 8785

0,61 (0,61–0,915)

0,008 (0,007–0,0117)

0,26 (0,26–0,262)

S. aureus АТСС 25923

0,031 (0,031–0,032)

0,063 (0,048–0,063)

0,094 (0,094–0,095)

S. aureus АТСС 6538

0,06 (0,053–0,094)

0,063 (0,051–0,063)

0,122 (0,122–0,133)

bogk2.wmf

Рис. 2. Изоболограмма для тестируемых штаммов S. aureus, построенная по результатам оценки действия комбинации антимикробных препаратов гентамицина и диоксидина методом «шахматной доски»

Построенная на основе результатов проведенных экспериментов изоболограмма (рис. 2) характеризовалась вогнутой формой, что также соответствует синергидному взаимодействию гентамицина и диоксидина в отношении тестируемых штаммов стафилококков.

Метод кинетических кривых гибели/роста бактерий подтвердил синергидный характер взаимодействия гентамицина и диоксидина в отношении всех изученных штаммов S. aureus. Далее в качестве примера приведены результаты оценки антимикробного действия исследуемых лекарственных средств в отношении клинического штамма MRSA8785. Не установлено подавления роста бактерий при индивидуальном воздействии на тест-штамм (рис. 3).

bogk3.wmf

Рис. 3. Кинетические кривые гибели/роста штамма MRSА 8785 под индивидуальным воздействием различных концентраций гентамицина или диоксидина. Примечание здесь и рис. 3: Ген МПК1 и ¼ МПК – гентамицин в концентрации 1,2 и 0,3 мкг/мл, Дио МПК1 и ¼ МПК – диоксидин в концентрации 2,44 и 0,61 мкг/мл

bogk4.wmf

Рис. 4. Кинетические кривые гибели/роста штамма MRSА 8785 под воздействием комбинаций гентамицина и диоксидина в различных концентрациях

При этом наиболее активным антимикробным компонентом был диоксидин в концентрации 2,44 мкг/мл, под воздействием которого к 24 часам от начала эксперимента концентрация инокулюма была 6,9 LgКОЕ/мл в сравнении с 8,3 в контроле и 8,0 при воздействии МПК гентамицина. В то же время комбинация гентамицина и диоксидина в субингибирующих концентрациях (1,2 мкг/мл и 2,44 мкг/мл соответственно) привела к снижению величины КОЕ/мл на 2,5 lg при сравнении с диоксидином в концентрации 2,44 мкг/мл и более чем 100-кратному снижению КОЕ/мл в сравнении с начальным инокулюмом (рис. 4).

В последние годы не только отдельные группы исследователей, но и многие рекомендации профессиональных ассоциаций по лечению различных инфекций призывают применять комбинации антибактериальных препаратов для преодоления резистентности у возбудителей. Синергизм – это усиление бактерицидного действия антибиотиков при их совместном применении. Гентамицин, препарат группы аминогликозидов, в отношении стафилококков обладает бактерицидным действием, однако метициллинорезистентные штаммы часто характеризуются ассоциативной устойчивостью к данному антибиотику [5], что имело место и в нашем исследовании, когда оба клинических изолята MRSA демонстрировали устойчивость к гентамицину. Механизм действия данного антибиотика связан с ингибированием рибосомальных субъединиц 30S. Несмотря на то, что еще в 2003 г. комбинация гентамицина и ванкомицина показала высокую эффективность в лечении эндокардитов, вызванных S. aureus [10], данную комбинацию нельзя рекомендовать к широкому применению, так как у нее существуют нежелательные эффекты, а именно – нарастание нефро- и ототоксичности. В инструкции по медицинскому применению гентамицина имеются четкие указания о том, что следует избегать одновременного и/или последовательного системного или местного применения других нейро- и/или нефротоксических средств, таких как цисплатин, цефалоридин, аминогликозидные антибиотики, полимиксин В, колистин, ванкомицин.

Неэффективность или потенциальная опасность доступных антимикробных препаратов при лечении тяжелых форм гнойной инфекции заставляет обращаться к альтернативным препаратам, к числу которых относится диоксидин. В основе механизма действия препарата лежит повреждение биосинтеза ДНК микробной клетки с глубокими нарушениями структуры нуклеоида уже при действии субингибирующих концентраций, при этом его активность существенно повышается в условиях анаэробиоза со снижением величины МПК в 8–128 раз [6]. Повышение активности в анаэробных условиях характерно для всех производных ди-N-окиси хиноксалина с антимикробной активностью и не описано для других классов антимикробных веществ. В этом принципиальное отличие механизма действия диоксидина от механизма действия других антимикробных препаратов. В условиях анаэробиоза, в том числе и в очаге инфекции, диоксидин (и другие ди-N-окиси) активирует свободнорадикальные процессы, индуцируя образование так называемых активных форм. Диоксидин не кумулирует в почках при повторных введениях, что делает его комбинацию с гентамицином более безопасной, чем ванкомицин и гентамицин.

В последние годы возросло количество публикаций об изучении активности комбинации диоксидина и изониазида в отношении микобактерий туберкулеза, которые характеризуются высокой резистентностью к широкому перечню антимикробных препаратов [1], а также применению диоксидина в клинической медицине для профилактики вентилятор-ассоциированных пневмоний, в комплексном лечении хирургических инфекций, оторингологии [2, 3, 7]. Кроме того, опубликованные результаты экспериментальных исследований свидетельствуют о том, что комбинация диоксидина с норфлоксацином характеризуется медленным развитием резистентности не только у стафилококков, но и грамотрицательных возбудителей. При этом приобретенная микроорганизмами устойчивость к данным препаратам нестабильна и восстановление чувствительности происходит относительно быстро [4]. Эти данные позволяют предположить, что комбинация диоксидина с гентамицином, обладающая синергидным действием, также не будет способствовать быстрому развитию приобретенной резистентности у штаммов-возбудителей.

Таким образом, усиление действия гентамицина с помощью разрешенного для системного использования химиопрепарата диоксидин обеспечивает потенцирование бактерицидного эффекта в отношении метициллинорезистентных штаммов стафилококков. Данная комбинация, по-видимому, способна эффективно подавлять гнойную инфекцию, не вызывая усиления нефротоксичности, так как диоксидин не вызывает изменения со стороны гломерулярного и тубулярного аппарата почек, что позволяет рассматривать возможность применения предложенной комбинации для лечения инфекций, вызванных полирезистентной стафилококковой флорой.