Разработка средств очистки почвы от нефтяных углеводородов является активно развивающимся направлением экологии и биотехнологии. На современном уровне развития нефтегазового комплекса не представляется возможным полностью исключить его негативное воздействие на окружающую среду. Проблема очистки окружающей среды от нефтяного загрязнения приобретает все большую остроту в связи с ограниченностью возможностей, а иногда и экологического вреда применяемых для этих целей механических и физико-химических способов очистки [1, 2]. Решение проблемы защиты окружающей среды, в первую очередь почв, состоит в активизации потенциала самоочищения почв и интродукции активных штаммов микроорганизмов – деструкторов нефти в виде биопрепаратов. В настоящее время наиболее перспективным методом для очистки нефтезагрязненных почв, как в экономическом, так и в экологическом плане, является биотехнологический метод, основанный на использовании различных групп микроорганизмов, отличающихся повышенной способностью к биодеградации компонентов нефти и нефтепродуктов [3, 4]. Способность к утилизации ксенобиотики обеспечивается наличием у микроорганизмов специфических ферментных систем, осуществляющих катаболизм таких соединений.
Искусственное внесение (интродукция) чистых или смешанных культур УОМ в загрязненную среду и создание благоприятных условий для их развития позволяет сократить сроки биоремедиации в пять и более раз [5].
Целью исследования являлась оценка эффективности применения биологического препарата «Энойл» на основе психротрофных нефтеокисляющих микроорганизмов в процессе деградации нефтепродуктов в почве в полевых условиях.
Материалы и методы исследования
Методика отбора почвенных образцов на химический анализ. Отбор проб почвы для определения содержания нефти проводили на выбранной площадке, на глубине 20–25 см. Отбирали 5 проб, взятых по методу «конверта» (по углам площадки и в центре), освобождали от различных включений и перемешивали. Затем методом квартования отбирали 1,0–1,5 кг почвы в полиэтиленовый мешок. Пробу упаковывали, маркировали.
Подготовка проб почвы к гравиметрическому анализу. Образцы отобранных почв высушивали до воздушно-сухого состояния. После высушивания пробу пересеивали через сито с размером отверстий 1 мм. Просеянную пробу почвы помещали на лист чистой бумаги, перемешивали и распределяли ровным слоем, толщиной около 0,5 см, делили на квадраты площадью 3*3 см и из каждого квадрата брали шпателем небольшое количество почвы, захватывая ее на всю глубину слоя, примерно около 5 г. Высушенные воздушно-сухие образцы почвы размельчали в агатовой ступке до пудрообразного состояния и хранили в пакетах из вощеной бумаги.
Определение содержания нефти в почве проводили гравиметрическим методом [6]. Сущность весового метода заключается в экстракции эмульгированных и растворенных нефтепродуктов из почвы хлороформом. Навеску помещали в колбу емкостью 150–250 мл, заливали хлороформом до влажного состояния. Затем несколько раз проводили экстракцию хлороформом до получения в последних порциях бесцветного экстракта. Полученную хлороформенную вытяжку выпаривали на водяной бане или в вытяжном шкафу. После испарения осадок хлороформа переносили в колонку, заполненную послойно стекловатой (1 см). В колонку добавляли 3–5 см3 гексана. Под носик колонки помещали заранее взвешенный стакан вместимостью 50 см3.
Оставшийся в стакане после испарения хлороформа осадок растворяли в 5–10 см3 гексана и проводили фильтрацию. Гексан испаряли при комнатной температуре. Стакан с оставшейся взвесью взвешивали до получения постоянной массы. Содержание нефтепродуктов (мг/кг) вычисляли по формуле
Х = А/В×1000, (1)
где А – количество нефтепродуктов, мг;
В – навеска почвы, г;
1000 – коэффициент перерасчета на кг почвы.
Результаты исследования и их обсуждение
Биоремедиационные работы по очистке почв, загрязненных нефтепродуктами, проводили с использованием разработанного нами ранее биологического препарата «Энойл», предназначенного для биодеградации нефтепродуктов при низких температурах. Препарат представляет концентрированную биомассу, полученную на основе микробной ассоциации с титром клеток 11,0 lgКОЕ/см3. В качестве нефтеокисляющих бактерий препарат содержит штаммы бактерий, выделенных из нефтезагрязненных почв Западного Казахстана и сточных вод: Rhodococcus erythropolis ДН-1, Bacillus amyloliquefaciens И-15 и Serratia marcescens Н3К. На базе испытательной лаборатории ТОО «Нутритест» Казахской академии питания проведены токсиколого-гигиенические исследования штаммов углеводородокисляющих микроорганизмов. По результатам исследований штаммы, входящие в состав биопрепарата, не патогенны, не токсичны и не токсигенны.
Испытания биопрепарата по очистке почв, загрязненных нефтепродуктами, проводили на базе Восточного филиала ТОО «Топливно-энергетический комплекс – Казахстан» в г. Тараз.
«Топливно-энергетический комплекс – Казахстан» – крупная сеть топливных баз в Казахстане, оказывающая услуги по хранению и перевалке дизельного топлива, бензина, мазута, печного топлива, сыпучих грузов, а также по реализации и хранению масел и смазок. Постановка полевого опыта включала несколько этапов:
1) оценка степени загрязненности нефтепродуктами выбранных участков,
2) обработка препаратом,
3) проведение контрольных замеров на содержание остаточных нефтепродуктов в почве.
Для закладки полевого опыта по биоремедиации нефтезагрязненной почвы был проведен осмотр территории и замерена площадь и глубина загрязнения. Экспериментальная площадка была разделена на 2 участка, подвергающихся регулярным и разовым розливам нефтепродуктов. Проводили отбор и подготовку образцов для проведения химического анализа с целью определения содержания нефтепродуктов. Перед началом проведения работ почву перекапывали на глубину 10–15 см. На одном из участков, загрязненных нефтепродуктами, вынимали почвенный грунт глубиной более 1,5 м.
С целью восстановления биопрепарата в полевых условиях использовали емкости вместимостью 200 литров, которые заполнялись водопроводной водой с питательной средой. В питательную среду вносили дизельное топливо в качестве источника углерода и энергии и концентрированный биопрепарат с титром клеток 1010 КОЕ/мл. Смесь перемешивали до однородной консистенции, подачу воздуха осуществляли с помощью компрессора. Биопрепарат восстанавливали в течение 48 часов, при постоянном перемешивании при температуре ~ 25–28 °С (рис. 1). Конечный объем полученного рабочего раствора составил приблизительно 600 л.
1 сутки 2 сутки 5 сутки
Рис. 1. Восстановление биопрепарата
до после
Рис. 2. Участок, загрязненный нефтепродуктами до и после обработки биопрепаратом
Полученный объем биопрепарата разводили водой в соотношении 1:4. Непосредственно после приготовления рабочего раствора биопрепарата проводили обработку почвы загрязненной нефтепродуктами из расчета 5 л разведенного препарата с титром клеток 109 lgКОЕ/г на 1 м3 обрабатываемой поверхности. Почву увлажняли, перемешивали.
Для оптимизации соотношения углерода (С) и азота (N), нарушенного вследствие загрязнения углеводородами, в почву вносили минеральное удобрение нитроаммофоску в соотношении 100:10, что оказывает благоприятное влияние для нормального роста и развития нефтеокисляющих микроорганизмов в загрязненной среде.
После обработки биопрепаратом проводили рыхление и увлажнение почвы. В качестве контроля использовали почву, загрязненную нефтепродуктами без внесения препарата. Препарат вносили на загрязненные участки в таком количестве, чтобы численность УОМ составила не менее 106 клеток/г почвы. Через 4 месяца отбирали пробы почв для анализа нефтеокисляющей активности биопрепарата.
При анализе почвенных проб было выявлено, что на исследуемых участках загрязнение нефтепродуктами составило: участок № 1 – 1,93 г/кг, участок № 2 – 3,54 г/кг.
Изучение динамики деструкции углеводородов на загрязненных участках показало, что через 4 месяца после начала эксперимента уровень деструкции нефти препаратом «Энойл» на первом участке составил 76,2 %, а на втором – 82 %. Результаты исследований приведены в таблице и на рис. 2.
Уровень деструкции нефтепродуктов в почве после внесения биопрепарата
|
Наименование пробы |
Содержание нефтепродуктов в почве, г/кг |
Степень утилизации нефтепродуктов в почве после обработки препаратом, % |
|
|
Исходное загрязнение |
через 4 месяца |
||
|
Участок 1 |
1,93 ± 0,23 |
0,46 ± 0,16 |
76,2 % |
|
Участок 2 |
3,54 ± 0,20 |
0,64 ± 0,04 |
82 % |
Данные таблицы показывают высокую эффективность биопрепарата как деструктора нефтепродуктов в почве. Степень утилизации нефтепродуктов при низких температурах после обработки нефтезагрязненной почвы биопрепаратом составила от 76,2 % до 82 %.
Заключение
Таким образом, по результатам проведенных испытаний препарата «Энойл» можно сделать вывод о том, что данный препарат может эффективно нейтрализовать нефтепродукты в почве. В течение 4 месяцев комплексная биоремедиация почвы с использованием препарата на завершающем этапе очистки привела к уменьшению содержания углеводородов на 82,0 %. Применение препарата позволяет ускорить процесс естественной регенерации загрязненных территорий.