Серологическая классификация вирусов традиционно основывается на классических подходах к выявлению антигенных различий. В частности, перекрестное взаимодействие штаммов в разных серологических тестах, наряду с результатами генетического анализа, стало основой выделения вирусов в отдельный род Hantavirus семейства Bunyaviridae [1]. В 2016 г. решением рабочей группы по Bunyaviridae Международного комитета по таксономии вирусов (ICTV) создан новый порядок Bunyavirales, включающий 8 семейств, в том числе Hantaviridae, и предложено новое название рода Orthohantavirus [2]. Согласно новой классификации на территории Приморского края установлена циркуляция по меньшей мере 4 видов ортохантавирусов: Hantaan (включая Amur), Seoul, Puumala (ранее Hokkaido) и Fusong (ранее Vladivostok). До настоящего времени подтверждена роль только первых двух вирусов в этиологии геморрагической лихорадки с почечным синдромом (ГЛПС) [3]. Генетические особенности ортохантавирусов, циркулирующих в нашем регионе, хорошо представлены Л.Н. Яшиной [4], тогда как антигенные характеристики штаммов этих вирусов, выделенных из разных источников – от диких/синантропных грызунов и больных ГЛПС, изучены недостаточно.
Цель данного исследования: изучить антигенные характеристики штаммов ортохантавируса Hantaan, выделенных от мышей Apodemus agrairus и A. peninsulae.
Материалы и методы исследования
В работе использованы штаммы рабочей коллекции лаборатории хантавирусных инфекций НИИ эпидемиологии и микробиологии имени Г.П. Сомова (табл. 1).
Выделение штаммов ортохантавирусов, накопление антигенов для проведения серологических реакций проводили на клеточной культуре Vero E-6, используя стандартные методики, коммерческие реактивы и питательные среды для культивирования клеток.
Для идентификации выделенных изолятов использовали реакцию нейтрализации, основанную на подавлении образования фокусов, которую проводили по методике Lee P.W. и соавт. [5]. Кратко, в равных объемах смешивали двукратные разведения сывороток крови иммунизированных животных (от 1:32 до 1:1024), 50-100 фокусообразующих единиц (ФОЕ) вируса и комплемент (1:100) и инкубировали 1 час при 37 °С, после чего вышеуказанную смесь вносили в дозе 0,2 мл в лунки 24-луночных планшетов с монослоем клеток Vero E6. После контакта в течение часа при 37 °С инокулят сливали, монослой однократно отмывали средой МЕМ и вносили 0,8 мл полужидкого покрытия, состоящего из среды Игла МЭМ, содержащей 0,6 % карбоксиметилцеллюлозы, 2,0 % СЭК, антибиотики. Планшет с инфицированными клетками инкубировали в течение 10–11 дней при 37 °С в термостате с 5 % содержанием CO2. Учет реакции проводили через 8–10 дней. Полужидкое покрытие сливали, клетки промывали один раз (для отмывки использовали 0,85 % раствор NaCl). После чего клетки фиксировали абсолютным спиртом при комнатной температуре по 400 мкл/лунку (15, 20 минут), после удаления фиксатива клетки отмывали 0,85 % раствором NaCl (3х10 минут). Затем вносили специфическую антихантавирусную сыворотку (сыворотка реконвалесцента ГЛПС, исходный титр 1:2048) в разведении 16–32 ед. по 200 мкл/лунку. После инкубации монослой отмывали (3х5 минут) раствором фосфатно-солевого буфера (ФСБ), содержащим 1 % Твин-20, и вносили меченный пероксидазой белок «А» 200 мкл/лунку (исходный титр 1:20000, 8–16 ед., разведение на трис-буфере с 0,05 % раствором Твин-20 и 0,1 % бычьего сывороточного альбумина) на 60 мин. при 37 °С. Затем монослой отмывали 0,85 % раствором NaCl (3х5 минут). Для выявления фокусов в лунки вносили субстрат по 400 мкл (рабочий раствор субстрата: к 8 мл ФСБ добавлены 1 мл раствора 3,3’диаминобензидина, 1 мл 0,6 % раствора NiCl2 и 4 мкл 30 % Н2О2.). Фокусы проявлялись в течение 5–15 минут, после чего панель промывали проточной водой, подсушивали и подсчитывали их количество. Титр вируса выражали в десятичных логарифмах, по количеству фокусов, образованных при внесении 0,2 мл вируссодержащей жидкости в лунку, и выражали в lg/1,0 мл. Титр нейтрализующих антител определяли по разведению сыворотки крови, приведшему к уменьшению количества фокусов на 80 %.
В качестве прототипных использовали штаммы 76–118 вируса Hantaan, Seo 80–39 вируса Seoul и CG 18–20 вируса Puumala. Гипериммунные сыворотки к выделенным и прототипным штаммам ортохантавирусов получали при иммунизации беспородных самцов белых крыс 4-недельного возраста при подкожном введении вируссодержащей жидкости с титром не менее 4,5 lg ФОЕ/1,0 мл, объем введения составлял 0,5 мл. Перед использованием в реакции нейтрализации иммунные сыворотки инактивировали нагреванием на водяной бане при температуре 56 °С в течение 40 мин.
Результаты исследования и их обсуждение
При проведении перекрестной реакции нейтрализации с иммунными сыворотками получены следующие результаты (табл. 2).
Между штаммами, выделенными от полевых мышей из Приморского края (ПМ-10508-89 и ПМ-95) и Южной Кореи (прототипный штамм 76–118 вируса Hantaan), выявлено близкое антигенное родство, разность титров нейтрализующих антител (нАТ) в перекрестных реакциях составляла 0–4.
Штаммы, выделенные от восточноазиатской мыши, характеризовались неоднородной картиной антигенных взаимоотношений. Штамм ВАМ 15-99, первый штамм, выделенный на культуре клеток в Приморском крае, может считаться прототипным штаммом серотипа Amur. Его антигенное отличие от штаммов, выделенных от полевой мыши, подтверждается результатами реакции нейтрализации: разность титров нАТ в иммунной сыворотке, полученной к этому штамму, к гетерологичным антигенам составляет более 4, что соответствует серологическому критерию серотипа хантавируса [1, 6]. Тогда как по разнице титров нАТ к гомологичным и гетерологичным антигенам (≤ 4) штаммы, ВАМ 25-04, ВАМ 26-04 и штамм ВАМ 16-04 имеют родство как к серотипу Hantaan, так и к серотипам Amur и Seoul. Штамм ВАМ 6-04 имеет близкое антигенное родство только с штаммами, выделенными от полевой мыши.
Таблица 1
Сведения о штаммах ортохантавирусов, использованных в исследовании
|
№ п/п |
Источник выделения штамма |
Название штамма в рабочей коллекции |
Географическое происхождение |
Год выделения |
|
1 |
Apodemus agrairus |
ПМ-79-95 |
Приморский край, Спасский р-он |
1996 |
|
2 |
Apodemus agrairus |
ПМ-10508-89 |
Приморский край, Спасский р-он |
1989 |
|
3 |
Apodemus peninsulae |
ВАМ 6-04 |
Приморский край, Надеждинский р-н |
2004 |
|
4 |
Apodemus peninsulae |
ВАМ-15-99 |
Приморский край, Надеждинский р-н |
2000 |
|
5 |
Apodemus peninsulae |
ВАМ-25-04 |
Приморский край, Надеждинский р-н |
2004 |
|
6 |
Apodemus peninsulae |
ВАМ-26-04 |
Приморский край, Надеждинский р-н |
2004 |
|
7 |
Apodemus peninsulae |
ВАМ-16-04 |
Приморский край, Надеждинский р-н |
2004 |
|
8 |
Apodemus agrairus |
76-118 |
Korea |
1976 |
|
9 |
Rattus norvegicus |
Seo 80-39 |
Korea |
1980 |
|
10 |
Myodes glareolus |
CG 18-20 |
Россия |
1984 |
Таблица 2
Результаты идентификации штаммов ортохантавирусов иммунными сыворотками в реакции нейтрализации
|
Штаммы, выделенные от A. agrairus и A. peninsulae |
Прототипные штаммы |
|||||||||
|
Иммунные сыворотки |
ПМ -79-95 |
ПМ -10508-89 |
ВАМ 6-04 |
ВАМ -15-99 |
ВАМ -25-04 |
ВАМ -26-04 |
ВАМ -16-04 |
76-118 |
Seo 80-39 |
CG 18-20 |
|
ПМ-79-95 |
512 |
512 |
128 |
< 32 |
< 32 |
< 32 |
< 32 |
256 |
< 32 |
< 32 |
|
ПМ-10508-89 |
256 |
512 |
128 |
< 32 |
< 32 |
64 |
< 32 |
64 |
< 32 |
32 |
|
ВАМ 6-04 |
128 |
256 |
256 |
< 32 |
< 32 |
32 |
32 |
128 |
< 32 |
< 32 |
|
ВАМ-15-99 |
< 32 |
< 32 |
< 32 |
256 |
64 |
64 |
32 |
< 32 |
< 32 |
< 32 |
|
ВАМ-25-04 |
32 |
32 |
< 32 |
64 |
128 |
64 |
64 |
32 |
32 |
< 32 |
|
ВАМ-26-04 |
32 |
32 |
< 32 |
128 |
64 |
128 |
32 |
< 32 |
32 |
< 32 |
|
ВАМ-16-04 |
32 |
32 |
< 32 |
64 |
32 |
32 |
128 |
32 |
32 |
< 32 |
|
76-118 |
256 |
256 |
128 |
< 32 |
32 |
32 |
64 |
512 |
< 32 |
< 32 |
|
Seo 80-39 |
64 |
64 |
< 32 |
64 |
< 32 |
32 |
< 32 |
< 32 |
1024 |
< 32 |
|
CG 18-20 |
< 32 |
< 32 |
< 32 |
< 32 |
< 32 |
< 32 |
< 32 |
< 32 |
< 32 |
128 |
Примечание. В таблице представлены обратные значения титров антител.
Результаты перекрестных реакций иммунных сывороток, приготовленных к исследованных штаммов и прототипному штамму CG 1820, со всей очевидностью свидетельствуют о том, что все исследованные штаммы ортохантавирусов, выделенные от диких грызунов в Приморском крае, не имели антигенного родства с вирусом Puumala.
Несмотря на длительную историю изучения вирусов, концепция определения вида в вирусологии до конца не разработана. Один из способов видовой дифференциации основан на изучении антигенных характеристик, однако существование постоянного антигенного дрейфа, дающего множество серологических типов одного вируса, уменьшает ценность серологического критерия в определении вида. В каждом случае вопрос об определении видовых границ решается индивидуально, так для хантавирусов был принят следующий критерий: разница титров нейтрализующих антител к гомологичному и гетерологичному антигенам должна превышать 4 [1, 5, 6].
Приморский край является уникальным очагом ортохантавирусной инфекции, в котором циркулирует несколько гено/серотипов ортохантавирусов в популяциях разных резервуарных хозяев, включая три патогенных для человека. Еще в конце прошлого века в работе Р.А. Слоновой и соавт. (1990 г.) на основании результатов исследования 15 штаммов ортохантавирусов, выделенных от больных ГЛПС и разных видов грызунов, в реакции нейтрализации и в непрямом методе флюоресцирующих антител с использованием моноклональных антител (МКА) сделано предположение об антигенном различии ортохантавирусов, выделенных от полевой и восточноазиатской мышей.
Как известно, антигенные и генетические варианты вируса в ряде случаев могут коррелировать, в других случаях – используются как разные подходы к характеристике одного вируса, то есть могут заменять, дополнять друг друга или быть единственной характеристикой вида. Выделение большего количества штаммов от мышей рода Apodemus позволило выявить четкие серологические и генетические различия, соответствующие критерию уникальности, и доказать самостоятельность серо/генотипа Amur [7–10]. Следует отметить, что несмотря на широкий ареал этого вируса, охватывающий Дальний Восток России, Китай и Корею, случаи ГЛПС, связанные с вирусом Amur, до настоящего времени зарегистрированы только на территории Российской Федерации [11].
Более четкие результаты при определении вида вируса дает использование в серологических реакциях МКА и изучение генов и их продуктов путем определения первичной структуры. Это привело к пересмотру классификации хантавирусов в 2016 г. [2], и в настоящее время вид ортохантавирусов Hantan включает геноварианты Hantaan, Amur и Soochong.
Результаты наших исследований свидетельствуют о высоком родстве штаммов, выделенных от полевой мыши, что детерминировано высокой гомологией нуклеотидных и аминокислотных последовательностей РНК ортохантавирусов, принадлежащих к географическому геноварианту Far East вируса Hantaan [4]. Неоднородность антигенных характеристик штаммов, выделенных от восточноазиатской мыши, в частности выделение отдельного серотипа Amur в рамках существующего вида, также может быть обусловлено наличием маркерных аминокислотных замен, характерных только для данного геноварианта [4].
Таким образом, несмотря на высокое генетическое родство ортохантавирусов вида Hantaan, циркулирующих у мышей рода Apodemus, антигенные характеристики штаммов позволяют выделить по меньшей мере два серотипа, связанные с грызунами разных видов.