Scientific journal

International Journal of Applied and fundamental research

ISSN 1996-3955

ИФ РИНЦ = 0,593

Метаболический синдром (МС), распространенность которого значительно возросла в последнее время, является одной из актуальных проблем современной медицины. Изучение патогенетических особенностей развития этого комплексного заболевания не вызывает сомнений, поскольку у пациентов с МС возникает повышенный риск появления атеросклероза, сахарного диабета 2-го типа, артериальной гипертонии, инсульта, инфаркта миокарда и других заболеваний [1]. Нарушения регуляции углеводного и жирового метаболизма в организме, возникающие при развитии МС вследствие инсулинорезистентности и гиперинсулинемии, приводят к ожирению, повышению свертывания крови, атеросклеротическому изменению в сосудах [2, 3].

Клинические и экспериментальные исследования, посвященные исследованию функционирования системы гемостаза при МС показали, что при данной патологии нарушается равновесие фибринолитической и протромботической активности крови вследствие гиперагрегации тромбоцитов в результате воздействия комплекса обменных нарушений и гемодинамических факторов, гиперкоагуляции за счет повышения активности факторов свертывания и уровня фибриногена, депрессии фибринолитической системы из-за уменьшения активности тканевого активатора плазминогена и возрастания его ингибитора ИАП-1 [2, 4, 5].

Таким образом, современное лечение МС предполагает многофакторный подход с применением средств, восстанавливающих метаболизм в органах и тканях, нормализующих функционирование системы гемостаза и углеводный обмен в организме.

Ранее было показано, что короткие пептиды, имеющие в своем составе аминокислоты пролин и глицин, обладают широким спектром биологических активностей и оказывают в организме противосвертывающее, гипохолестеринемическое, гипогликемическое действие, а также замедляют накопление жировой ткани [4]. В экспериментах in vivo установлено, что пептид Arg-Pro-Gly-Pro проявляет антитромботические, антикоагулянтно-фибринолитические эффекты и гипогликемическую активность при экспериментальной гипергликемии и гиперхолестеринемических состояниях организма [4, 6]. Также известно, что тиреотропные гормоны, в том числе тиролиберин, оказывают влияние на метаболические процессы в организме: подавляют синтез холестерола, триацилглицеридов, активируют метаболизм глюкозы и снижают массу тела [7].

Мы предположили, что смесь двух пептидов может обладать большей эффективностью при коррекции параметров системы гемостаза, а также метаболизма жиров и углеводов.

Цель работы – исследовать эффективность действия разных доз смеси коротких пролинсодержащих пептидов «Pyr-His-Pro-NH2 + Arg-Pro-Gly-Pro» на липидный и углеводный обмен, состояние системы гемостаза и изменение массы тела в условиях экспериментального метаболического синдрома у крыс.

Материалы и методы исследования

Исследования проведены на 40 беспородных белых крысах-самцах массой 300 ± 20 г (питомник «Столбовая») с соблюдением принципов биоэтики в соответствии с международными принципами Европейской конвенции о защите позвоночных животных, используемых для экспериментов или других научных целей. Все животные были разделены на 4 группы (в каждой группе n = 10): «Норма» – здоровые крысы без лечения; «МС» – крысы с метаболическим синдромом без лечения; «МС + смесь 100» – крысы с МС, которым вводили смесь пептидов в дозе 100 мкг/кг массы тела; «МС + смесь 50» – крысы с МС, которым вводили смесь пептидов в дозе 50 мкг/кг массы тела.

В работе применяли пептиды Pyr-His-Pro-NH2 (тиролиберин, Pyr-HP) и Arg-Pro-Gly-Pro (RPGP), синтезированные и предоставленные Институтом молекулярной генетики РАН (Москва). Смесь пептидов в весовом соотношении 1:1 готовили ежедневно, навеску растворяли в физиологическом растворе непосредственно перед использованием.

Моделирование МС осуществляли содержанием крыс на разработанной нами ранее высококалорийной диете (ВКД) [4]. В качестве питья животные получали 10 %-ный раствор глюкозы. Энергетическая ценность диеты составляла 355 ккал/100 г рациона. Для развития метаболических нарушений крысы групп «МС», «МС + смесь 50» и «МС + смесь 100» получали ВКД в течение 3 месяцев (90 дней). Затем животным групп «МС + смесь 100» и «МС + смесь 50» с 90-го по 96-й день эксперимента 7-кратно 1 раз в сутки интраназальным способом вводили смесь пептидов в дозах 50 или 100 мкг/кг соответственно, а группе «МС» – в те же сроки и подобным образом – 0,85 %-ный физиологический раствор. Животные группы «Норма» в течение всего периода эксперимента содержались на стандартном гранулированном рационе «Лабораторкорм» (энергетическая ценность – 295 ккал/100 г) при свободном доступе к пище и воде.

Отбор образцов крови для проведения исследований производили дважды: на 97-й день эксперимента (через 20 ч после 7-го введения препаратов/физиологического раствора) и на 104-й день (через 7 суток после прекращения применения препаратов). Взятие крови с цитратом натрия в качестве консерванта осуществляли натощак из яремной вены. В цельной крови измеряли уровень глюкозы на биохимическом анализаторе One Touch Horison (США), используя тест-полоски для данного прибора.

Далее образцы крови центрифугировали 5 мин при 1000 g для получения плазмы, богатой тромбоцитами (PRP), а затем – 12 мин при 3000 g для получения бедной тромбоцитами плазмы (PPP).

В PRP определяли агрегацию тромбоцитов по Борну; в РРР – активированное частичное тромбопластиновое время (АЧТВ) с использованием набора «АЧТВ-тест» (Технология-Стандарт, Россия), суммарную фибринолитическую активность (СФА), неферментативный (НФ) и ферментативный фибринолиз (ФФ) на пластинах нестабилизированного фибрина [8].

Показатели липидного спектра (концентрацию общего холестерина (ОХс), холестерина липопротеидов высокой плотности (Хс-ЛПВП), триглицериды (ТГ)) в РРР измеряли энзиматическим колориметрическим методом с использованием реактивов «Ольвекс-Диагностикум» (Россия). Суммарную концентрацию Хс-(ЛПНП + ЛПОНП), обозначенную как Хс-ЛПНП, рассчитывали по формуле Хс-ЛПНП = ОХс – Хс-ЛПВП.

Для контроля динамики изменения массы тела животных осуществляли их взвешивание в 1 (перед началом ВКД), на 30, 60, 90 (перед началом лечения), 97 (после 7-кратного введения препаратов) и 104-й (через 7 суток после отмены лечения) дни эксперимента.

Статистическую обработку данных выполняли с помощью пакета прикладных программ STATISTICA 8.0. Результаты представлены в виде M ± m, где M – среднее арифметическое, m – ошибка средней. Данные в исследуемых группах проверяли на нормальность распределения с помощью критерия Колмогорова – Смирнова. Определение различий сравниваемых независимых выборок проводили с использованием t-критерия Стьюдента (в случае нормального распределения) и непараметрического критерия Вилкоксона, Манна – Уитни (при отличии от нормального распределения). Уровень статистической значимости р принимали равным 0,05.

Результаты исследования и их обсуждение

Как показали наши эксперименты, содержание крыс на ВКД в течение 3 месяцев приводило к развитию у животных нарушений липидного и углеводного обмена, а также дисфункции системы гемостаза. Так, в плазме крови этих животных (группа «МС») наблюдалось повышение концентрации ОХс на 18 % (p < 0,05), значительное увеличение концентрации ТГ и Хс-ЛПНП – на 143 и 132 % соответственно (p < 0,01) и снижение концентрации Хс-ЛПВП – на 14 % (p < 0,05) по сравнению с группой «Норма» (таблица). При этом отмечено повышение уровня глюкозы в крови животных с МС в 2 раза (p < 0,01) по сравнению со здоровыми животными. Также содержание крыс на ВКД способствовало развитию у них ожирения, поскольку за 3 месяца диеты масса тела в группах с МС возросла на 162 ± 5 г, что составило 191 % от значений группы «Норма» (рисунок). Это сопровождалось развитием гиперкоагуляции и угнетением фибринолиза: время свертывания по тесту АЧТВ было снижено на 27 % (p < 0,01), а СФА, НФ и ФФ уменьшались на 40, 37 и 54 % соответственно (p < 0,01) относительно «Нормы». Также у этих животных отмечено усиление агрегации тромбоцитов на 20 % (p < 0,05) по сравнению с соответствующим показателем у здоровых животных.

Полученные данные свидетельствовали о развитии основных признаков МС у крыс, которых в течение длительного времени содержали на ВКД. В дальнейшем с этими животными проводили эксперименты по введению исследуемых препаратов.

Через 20 ч после 7-кратного интраназального применения смеси пептидов в дозах 100 и 50 мкг/кг в крови животных отмечалось снижение концентрации Хс-ЛПНП на 37 и 45 % соответственно (p < 0,01) по сравнению с группой «МС». Достоверное уменьшение концентрации ОХс на 18 % (p < 0,05) и ТГ на 52 % (p < 0,01) отмечено только в группе «МС + смесь 50». Через 7 суток после прекращения лечения в группе «МС + смесь 50» показатели липидного спектра оставались достоверно сниженными, а в группе «МС + смесь 100» концентрация Хс-ЛПНП сохранила прежние значения и отмечено снижение ОХс на 15 % (р < 0,05) относительно «МС». Следовательно, по характеру влияния на показатели липидного профиля наибольший эффект, сохраняющийся в течение недели после отмены лечения, установлен при дозе 50 мкг/кг.

В этих условиях эксперимента уровень глюкозы в крови животных с МС, которым вводили смесь пептидов, не отличался от значений в группе «МС» ни после введения препаратов, ни через неделю после их отмены.

При этом введение животным с МС препаратов «Смесь 50» и «Смесь 100» оказывало влияние на состояние системы гемостаза. Так, через 20 ч после 7-го введения препаратов в группе «МС + смесь 50» выявлено достоверное удлинение времени свертывания (по АЧТВ) на 40 % (p < 0,01) относительно значений группы «МС». Антикоагулянтная активность плазмы крови крыс этой группы оставалась повышенной (на 27 %, p < 0,05) по сравнению с группой «МС» и через 7 суток после отмены лечения. Введение препарата в дозе 100 мкг/кг приводило к менее выраженному противосвертывающему эффекту, поскольку удлинение АЧТВ относительно группы «МС» носило недостоверный характер (p > 0,05). По другим параметрам гемостаза (фибринолитическая активность и агрегация тромбоцитов) наблюдались практически одинаковые эффекты при введении обеих доз смеси пептидов. Как видно из данных таблицы, через 20 ч после введения смеси пептидов в дозе 50 мкг/кг в плазме крови животных происходило повышение СФА, НФ и ФФ на 100, 72 и 165 % соответственно (p < 0,01), а при дозе 100 мкг/кг увеличение этих показателей составило 115, 90 и 181 % соответственно (p < 0,01) по сравнению с группой «МС». АТ плазмы крови крыс в группе «МС + смесь 50» была снижена на 74 % (p < 0,01), а в группе «МС + 100» – на 67 % (p < 0,01) относительно значений группы «МС». Через 7 суток после отмены лечения фибринолитическая активность плазмы крови животных в группах «МС + смесь 50» и «МС + смесь 100» оставалась повышенной по сравнению с группой «МС»: СФА, НФ, ФФ на 77–98 %, 69–76 % и 130 % соответственно (p < 0,01). При этом АТ была значительно снижена в обоих случаях на 65 % (p < 0,01) относительно «МС».

Изучение изменения массы тела крыс показало, что в группах животных с МС, подвергавшихся лечению, прирост массы тела (привес) был достоверно ниже, чем в группе «МС». В группе «МС + смесь 100» привес массы тела составил 22 ± 4,3 г, что на 41 % ниже, чем у животных с МС без лечения (p < 0,01). При введении животным смеси в дозе 50 мкг/кг привес за этот же период был еще меньше и составил 6,7 ± 1,6 г, что на 82 % меньше, чем в группе «МС» (p < 0,01). Следовательно, наибольший эффект замедления роста массы тела оказывала смесь пептидов, используемая в дозе 50 мкг/кг.

Представленные в настоящей работе данные указывают, что смесь пептидов Pyr-HP + RPGP восстанавливала нормальные значения показателей общего холестерина, липидного профиля и предотвращала накопление жировой массы (т.е. прибавку в весе) даже при одновременном употреблении в пищу продуктов, приводящих к повышению уровня холестерина и атерогенных липопротеидов в крови. Это, возможно, связано со структурными особенностями указанных пептидов, поскольку присутствие аргинина в структуре молекулы пептида способствует появлению в кровотоке оксида азота, который обеспечивает гиполипидемический эффект, присутствие гистидина обеспечивает нормальный жировой обмен [6]. Наличие в составе пептидов пролина, глицина, аргинина и гистидина способствовало восстановлению тканей после повреждений, оказывая положительное влияние на общее состояние и обмен веществ организма. С другой стороны, это может быть обусловлено нормохолестериновым действием самих пептидов. Обращает на себя внимание тот факт, что по влиянию на липидный профиль и способности препаратов пептидов замедлять прирост массы тела животных низкая доза смеси пептидов (50 мкг/кг) более эффективна, чем доза 100 мкг/кг.

Также впервые установлены антикоагулянтно-фибринолитические и антитромбоцитарные эффекты смеси этих пептидов в крови крыс, постоянно употребляющих жирную пищу с избытком глюкозы. У подопытных животных при этом активировалось функциональное состояние противосвертывающей системы крыс: снижалась агрегация тромбоцитов, повышалась фибриндеполимеризационная (неферментативная фибринолитическая) активность и антикоагулянтные свойства плазмы крови под действием пептидов. Антитромбоцитарный и фибриндеполимеризационный эффекты пептидов, вероятно, обусловлены взаимодействием их с фибриногеном и исключением его из процессов свертывания крови, поскольку есть данные о связи фибриногена с его рецепторами на тромбоцитах [9]; антикоагулянтный – ингибированием активности тромбина [10].

При сравнении действия двух доз смеси пептидов на параметры гемостаза наиболее значимый эффект по АЧТВ отмечается при дозе 50 мкг/кг, по разным видам фибринолиза и агрегации тромбоцитов эффекты при обеих дозах были сходны.

Таким образом, применение смеси исследованных нами коротких пролинсодержащих пептидов может обогатить современную метаболическую терапию и исключить возможные нежелательные последствия вмешательства в липидный метаболизм в отличие от применяемых в настоящее время медикаментов (фибратов, статинов, ингибиторов β-окисления жирных кислот).

Выводы

Следовательно, на фоне ВКД многократное интраназальное введение смеси пептидов «тиролиберин + RPGP» приводило к усилению антикоагулянтно-фибринолитического потенциала и проявлению их антитромбоцитарного эффекта в крови животных, причем эта картина сохранялась и после отмены введения препаратов.

Изменение массы тела животных в процессе проведения эксперимента. # – p < 0,05; ## – p < 0,01 – по сравнению с группой «Норма», * – p < 0,05; ** – p < 0,01 – по сравнению с группой «МС»