Ремоделирование костной ткани является механизмом, направленным на сохранение ее гомеостаза, обеспечение ее роста и обновления. Нормальное костное ремоделирование представляет собой сбалансированное сочетание процессов резорбции, осуществляемой остеокластами и формирования костной ткани, за которое ответственны остеобласты. Избыточная резорбция является главным патогенетическим фактором потери костной массы и развития разных форм остеопороза, в том числе – идиопатического, а также вызванного возрастными изменениями, дисфункцией гонад, воспалительными заболеваниями [1, 2]. Катепсин К является ключевой коллагеназой остеокластов. В данном обзоре будет рассмотрена роль катепсина К в ремоделировании матрикса костной ткани и механизмы регуляции его активности.
Сигналом для миграции остеокластов к будущему месту резорбции являются микропереломы, в результате которых матриксные металлопротеазы остеоцитов попадают во внеклеточный матрикс кости. Под действием матриксных металлопротеаз поврежденных остеоцитов высвобождаюятся такие цитокины, как RANKL, OPG, M-CSF и TGF? [3], а также происходит их процессинг, благодаря которому они превращаются в свои активные формы. Специфические продукты протеолиза белков матрикса, осуществленного металлопротеазами, служат сигналами к прикреплению остеокластов [4]. Интегриновые рецепторы остеокластов узнают специфические аминокислотные последовательности коллагена, фибронектина, остеопонтина, тромбосподина, костного сиалопротеина, витронектина [5], после чего прикрепляются к участку матрикса кости, подлежащему резорбции. Из этого следует, что не только количество и качество рецепторов на остеокластах играет роль в их прикреплении, но и состав, и специфика матрикса кости, а также состояние и количество остеоцитов, гибнущих в результате микропереломов. Нагруженность остеоцитов матриксными металлопротеазами обеспечивает степень интенсивности сигнала, усиливающего дифференцировку и миграцию остеокластов.
После прикрепления остеокласты изменяют свою функциональную активность, формируют так называемую гофрированную мембрану с большим количеством выпячиваний и приступают к резорбции кости. Наличие карбангидразы II в остеокластах способствует выработке протонов, которые под действием специальной АТФ-азы перемещаются через плазматическую мембрану в прелакунарное пространство [6]. Остеокласты способны закислить среду в прелакунарном пространстве до рН 3 всего за несколько минут [7]. Закисление среды в резорбционной лакуне способствует растворению кристаллов гидроксиапатита и протеолизу белков матрикса кости. После закисления среды в резорбционную лакуну остеокластами экскретируются протеолитические ферменты.
Одним из ферментов, играющих ключевую роль в резорбции костной ткани, является катепсин К. Помимо катепсина К в резорбционную лакуну остеокластами экскретируются катепсин В и катепсин L, относящиеся к семейству цистеиновых протеаз, и катепсин E, принадлежащий к семейству аспартильных протеаз. В течение резорбции остатки подвергшихся протеолизу белков поглощаются остеокластами и поступают в лизосомы, где подвергаются дальнейшей деградации катепсином D [8]. Несмотря на присутствие в резорбционной лакуне катеписинов В и L, их роль в деградации костного матрикса крайне мала. Существуют данные о том, что мРНК катепсина L совершенно не экспрессируется в остеокластах человека, а селективные ингибиторы катепсина L не предупреждают резорбцию кости остеокластами [9]. Несмотря на это, на культуре клеток черепа показано, что при культивировании остеокластов с витамином D3, паратиреоидным гормоном, ИЛ-1?, ИЛ-6 или с ФНО? повышается уровень катепсина L, но не катепсина К. Однако при отсутствии такой стимуляции остеокластов в культуре резорбция кости ингибируется только в случае добавления в культуру ингибиторов катепсина К [10].
Катепсин К (код классификации ферментов 3.4.22.38) относится к семейству папаиноподобных цистеиновых протеаз и является основной специфичной протеазой остеокластов и активированных макрофагов [11]. Помимо остеокластов катепсин К экспрессируется в преостеокластах, эпителии бронхов, желчных протоков, щитовидной железы [12], хондроцитах [4] гладкомышечных клетках артерий, пораженных атеросклерозом [13]. Ген катепсина К человека расположен в 1q21 [14] по соседству с геном катепсина S [15]. Показано, что дефект пропептида катепсина К и мутации полипептидной цепи зрелой формы фермента, препятствующие правильному фолдингу белка, приводят к неспособности катепсна К связывать, а значит, и расщеплять коллаген. Результатом этого является развитие пикнодисостоза, – дисплазии скелета, проявляющейся нарушением ремоделирования костной ткани, что ведет к остеосклерозу, частым переломам, дисплазии ключиц, акроостеолизису дистальных фаланг [16].
Катепсин К синтезируется в виде профермента с молекуляной массой около 35 кДа. Зрелый энзим представляет собой относительно небольшой белок, молекулярная масса зрелого человеческого катепсина К составляет 23,5 кДа [14, 17]. Установлено, что катепсин К крыс и человека имеет более 80 % гомологии [18], поэтому катепсин К крыс и их остеокласты могут служить адекватной моделью для тестирования веществ, регулирующих активность этой коллагеназы, и для изучения ответа остеокластов на попытки изменения их резорбционной активности.
В отличии от других катепсинов, которые секретируются клетками в виде зимогенов, катепсин К секретируется остеокластами в активной зрелой форме [19].
Ферментативная активность катепсина К схожа с таковой катепсина S [20]. Он, как и катепсин S, предпочитает объемные гидрофобные остатки в субсайте S2, но в отличие от последнего, лучше связывает ?-разветвленный валин. Фермент имеет колокол-подобный профиль рН с широким оптимумом от 5 до 8 [18], что делает этот фермент весьма устойчивым в среде организма и потенциально очень разрушительным в отношении белковых структур. Катепсин К способен расщеплять многие белки: эластин, желатин, остеопонтин, остеонектин [20, 21], коллаген [13], белковый кор аггрекана как в интерглобулярном, так и в прикрепляющемся к гиалуронану глобулярном домене [22]. Характерным отличием катепсина К от других протеаз, расщепляющих только телопептиды коллагена, является его способность расщеплять 3-х спиральный коллаген. Расщепление 3-х спирального коллагена осуществляется посредством образования комплекса, представляющего собой кольцо из пяти молекул катепсина К, связанных между собой хондроитинсульфатом [17]. При этом активные центры молекул фермента направлены внутрь кольца. Образованию комплекса предшествует расщепление катепсином К кора аггрекана в специальных сайтах, что способствует высвобождению растворенного хондроитинсульфата [22]. Образовавшийся комплекс охватывает фибриллу коллагена и при продвижении комплекса вдоль спирали коллагена, расщепляет его на пептиды, состоящие из 6–8 аминокислотных остатков, в то время как металлопротеазы способны расщеплять коллаген лишь в 2–3 сайтах [23, 24]. Кроме того, катепсин К может осуществлять протеолиз внутри спиралей коллагена в сайте, специфичном для металлопротеаз. Все это делает его уникальной коллагеназой. Вместе с тем адекватное содержание протеогликанов в матриксе костной ткани важно для осуществления адекватной резорбции костной ткани.
Кроме активного и непосредственного участия в расщеплении костного матрикса, катепсин К за счет активирования тартратрезистентной кислой фосфатазы остеокластов путем ограниченного протеолиза, опосредует дефосфорилирование остеопонтина, что приводит к ингибированию костной резорбции [25]. Таким образом, он осуществляет ауторегуляцию своей активности через кислую фосфатазу. Однако этот ресурс контроля над активностью катепсина К ограничен экспрессией тартрат-резистентной кислой фосфатазы. При повышенной активности и/или экспрессии катепсина К и базальной экспрессии и/или активности кислой фосфатазы этот путь регуляции активности может не обеспечивать эффективность данной обратной связи.
В активно резорбирующих остеокластах везикулы с катепсином К транспортируются к прелакунарному пространству, и катепсин К экскретируется в резорбционную лакуну, где начинает лизировать костный матрикс. Затем катепсин К вместе с продуктами деградации матрикса подвергается эндоцитозу, впоследствии с эндоцитозными везикулами сливаются везикулы, содержащие мономерную костную ТРКФ. Катепсин К активирует костную ТРКФ, и она начинает генерировать активные формы кислорода, завершая таким образом, деградацию компонентов матрикса [25]. В связи с этим делается вывод о том, что повышенная активность костной ТРКФ связана не с интенсивностью резорбции, а с количеством остеокластов. Это подтверждает и тот факт, что у больных пикнодизостозом несмотря на низкую способность остеокластов к резорбции, что ведет к повышенному их содержанию в костной ткани, активность костной ТРКФ повышена [12]. С другой стороны, группа исследователей на крысиных остеокластах показала, что покоящиеся остеокласты выделяют гораздо меньшее количество костной ТРКФ, чем резорбирующие [26].
Регуляция экспрессии катепсина К в остеокластах осуществляется целым рядом гормонов и цитокинов. Судя по уровню мРНК, интерферон гамма, ИЛ-10, -12,-18 уменьшает, а ИЛ-1, -6, -11, -15, 17 – увеличивают экспрессию катепсина К в остеокластах [14]. RANKL способствует усилению экспрессии катепсина К, а остеопротогерин ее снижает [27]. Показано, что под действием эстрогенов снижается экспрессия и секреция остеокластами катепсина К, а также катепсина L и гиалуронидазы [28]. Эффект эстрогенов на остеокласты опосредуется мембранным рецептором, при присоединении к которому запускается каскад фосфорилирования различных белков, включая src [29]. О значительной степени подавления 17?-эстрадиолом экспрессии катепсинов К и L в остеокластах, полученных из костей черепа мышей, свидетельствует факт снижения экспрессии этих ферментов в культуре клеток при предварительном введении мышам в течение 2-х недель 17?-эстрадиола в дозе 10 мкг/кг, несмотря на присутствие в среде культивирования паратиреоидиного гормона, ИЛ-1, ИЛ-6 и ФНО [30]. Выявлено, что кальцитонин подавляет экспрессию катепсина К на уровне мРНК, а ПТГ, напротив, – увеличивает [14]. На остеокластах кролика установлено, что ретиноевая кислота стимулирует усиление кость-резорбирующей активности остеокластов путем увеличения экспрессии катепсина К в дозо- и времязависимой манере, ее эффект реализуется быстрее, чем эффект витамина D3 [31].
На посттрасляционном уровне активность катепсина К регулируется протеолитической активацией, протеолитической деградацией, уровнем рН, ингибиторами, концентрацией субстрата, колебаниями в резорбционной лакуне концентрации кальция.
Протеолитическая активация катепсина К может осуществляться аспартильной протеазой катепсином D [32]. Не исключено, что другие протеазы также вносят свой вклад в активацию катепсина К. Аутоактивация катепсина К осуществляется путем ограниченного протеолиза при рН 4.0, приводящему к изменению конформации пропептида, благодаря чему становится возможным его гидролиз активным центром фермента [17].
Как у многих ферментов, период полужизни катепсина К в условиях неоптимальных для реакции увеличивается при наличии насыщающей концентрации субстрата [33].
На лизосомальном экстракте клеток кости мыши показано, что активность катепсинов может регулироваться концентрацией свободного кальция в среде: ее повышение ведет к значительному увеличению активности катепсинов, что, в частности, проявляется усилением деградации коллагена [7]. Это дает основание предполагать, что чем больше кальция содержит костная ткань, тем активнее может протекать процесс резорбции, а значит фаза резорбции, а за ней и фаза формирования новой костной ткани остеобластами сокращается во времени.
Активность катепсина К может подавляться цистатинами, – эндогенными ингибиторами цистеиновых протеаз, представляющими собой небольшие белки, состоящие из 120 аминокислотных остатков, блокирующие активный центр фермента [34].
Цистатин С экскретируется различными типами клеток, показано, что его экскретируют остеобласты и остеокласты [35]. Внутри остеокласта синтезированные цистатин С и катепсин К находятся в разных компартментах. В течение резорбции в резорбционную лакуну выделяется катепсин К, предварительно активированный катепсином D, и цистатин С, который, связываясь с катепсином К, регулирует интенсивность резорбционного процесса. После этого образовавшийся комплекс посредством эндоцитоза попадает в лизосомы, где происходит его расщепление катепсином D [32].
Помимо участия непосредственно в процессах резорбции катепсин К участвует в дифференцировке остеокластов [36] и адипоцитов [37]. Известно, что увеличение веса за счет содержания жировой ткани и остаточный уровень эстрогенов у женщин в постменопаузе [38] и овариэктомированных крыс [2] рассматривается как компенсаторный механизм, защищающий костную систему от остеопороза. Поэтому катепсин К, синтезируемый в жировой ткани, принимающий участие в деградации коллагена I типа в матриксе жировой ткани [39] и тем самым выступающий в роли индуктора дифференцировки адипоцитов [10], в определенной мере является фактором, сдерживающим развитие остеопороза. Поскольку содержание жировой ткани в теле животных и человека значительно, то при определении концентрации [40, 41] или активности катепсина К в сыворотке крови как маркера остеопороза [2, 42] необходимо учитывать, что источником сывороточного катепсина К могут служить не только костная, но и жировая ткань.
Таким образом, катепсин К является наиболее эффективной протеазой остеокластов, этим объясняется его ключевая роль в деградации костного матрикса. Регуляция остеокластогенеза и активности катепсина К происходит однонаправленно под действием различных цитокинов и гормонов. На сегодняшний день стало ясным, что одной их причин остеопороза или фактором, усугубляющим его течение, является увеличение провоспалительного фона организма любого генеза. Одновременно с этим компенсаторное увеличение доли жировой ткани, судя по последним данным, может играть положительную роль в предотвращении или замедлении развития остеопороза. Однако остается неясным мера вовлеченности катепсина К в адипогенез, а также существует ли корреляция его экспрессии в адипоцитах с временным интервалом набора веса. В связи с этим не ясны доли катепсина К, определяемого в сыворотке, происходящего из костной и жировой ткани при остеопорозе у женщин. Исследование этого вопроса является важным для понимания связи усиленной резорбции кости и компенсаторного накопления жировой ткани, а также поможет определить ограничения для тестирования активности и/или концентрации катепсина К в крови у женщин, если таковые имеются.