Scientific journal
International Journal of Applied and fundamental research
ISSN 1996-3955
ИФ РИНЦ = 0,578

THE EFFECT OF CHRONIC MODERATE STRESS ON THE STATE OF THE INTESTINAL DIGESTIVE SYSTEM IN RATS

Gromova L.V. 1 Dmitrieva Yu.V. 1 Alekseeva A.S. 1 Polozov A.S. 1 Gruzdkov A.A. 1
1 I.P. Pavlov Institute of Physiology RAS
2036 KB
The three-hour everyday immobilization of rats for 16 days resulted in an increase (in comparison with the control – in absence of the immobilization) of activity of glucoamylase (the key enzyme in carbohydrates hydrolysis) and in an increase of glucose absorption in the small intestine after 3 days of the stress applying. At more long terms (10 and 16 days), these indicators did not differ from the control. Adaptation of alkaline phosphatase and aminopeptidase N (the enzymes that perform, in addition to participation in hydrolysis of fats and proteins, important protective functions) to the above stress-factor occurred for longer time (16 days). The results obtained demonstrate the features of adaptation of different functional parameters of the rat small intestine to chronic moderate stress.
small intestine
stress
glucose absorption
digestive enzymes

Хронический стресс многими исследователями рассматривается в качестве одной из причин, способствующих развитию таких широко распространённых в мире патологий, как метаболический синдром, диабет 2-го типа, воспалительное заболевание кишечника [1, 2]. В связи с этим большой теоретический и практический интерес представляют исследования, которые направлены на выявление метаболических нарушений, вызванных хроническим стрессом.

В последние годы эффекты хронического стресса в отношении пищеварительной системы, обеспечивающей начальные этапы метаболизма пищевых веществ, широко изучались как на клиническом уровне, так и в модельных опытах на животных. Показано, что для хронического стресса характерно образование язв в желудке и двенадцатиперстной кишке [3], раннее появление признаков воспаления в кишечнике [2] и изменение ряда его функциональных параметров (моторика, кровоток, пассивная проницаемость эпителия) [2]. Вместе с тем до сих пор остаётся недостаточно изученным вопрос о возможном действии хронического стресса на мембранное пищеварение, обеспечивающее заключительные стадии гидролиза пищевых веществ, а также на систему всасывания глюкозы.

Цель настоящей работы состояла в том, чтобы в опытах на крысах, как экспериментальной модели, оценить влияние хронического умеренного стресса, вызванного ежедневной 3-часовой иммобилизацией животных на протяжении 3–16 дней, на активность ряда мембранных пищеварительных ферментов (глюкоамилаза, щелочная фосфатаза, аминопептидаза N) и на всасывание глюкозы в тонкой кишке.

Материалы и методы исследования

Эксперименты проводились на 48 взрослых крысах (Вистар, самцы, масса тела 180 – 220 г) в полном соответствии с Директивой Европейского Совета (The European Council Directive (86/609/EEC)) по соблюдению этических принципов в работе с лабораторными животными и одобрены Комиссией по контролю за содержанием и использованием лабораторных животных при ФГБУН Институт физиологии им. И.П. Павлова РАН.

Перед опытами и в ходе их проведения (за исключением периодов с 3-часовой иммобилизацией крыс опытных групп) животные содержались в нормальных условиях в отношении температуры и освещения, а также имели свободный доступ к стандартному лабораторному корму и воде.

Уровень всасывания глюкозы в тонкой кишке оценивался с использованием разработанной нами ранее методики [4], основанной на существовании высокой степени корреляции между скоростью свободного потребления животными, предварительно голодавшими 18–20 ч, концентрированных растворов глюкозы и способностью тонкой кишки к ее всасыванию.

В предварительных опытах в течение 5–6 ч у всех крыс регистрировалась временнaя динамика свободного потребления ими раствора глюкозы (200 г/л). Для этого каждое животное после предварительного голодания в течение 18–20 ч помещали в индивидуальную клетку размером 14х21х11 см с двумя мерными поилками, в одной из которых содержался раствор глюкозы в концентрации 200 г/л, а в другой – обычная вода. Однако следует отметить, что на протяжении всего опыта крысы пили только раствор глюкозы. По данным проведенных измерений методом линейной регрессии с использованием программного ресурса «ORIGIN 7» (OriginLabCorporation, USA) для каждого из животных определялось среднее значение объемной скорости (мкл/мин) потребления этого раствора во временном интервале от 60 до 300–360 мин, когда, как показали наши предшествующие исследования [4], эта скорость относительно постоянна. На основе результатов, полученных в нескольких предварительных опытах, было сформировано шесть групп крыс (три – опыт и три – контроль) с близкими средними значениями скоростей потребления раствора.

Животных из опытных групп ежедневно подвергали трёхчасовой иммобилизации в отдельных специальных клетках, частично ограничивающих их подвижность, а у контрольных – на 3 часа отбирали корм. Этот вид стрессорного воздействия является моделью умеренного психологического и физического стресса [1]. Опыты с иммобилизацией проводили в дневное время с 10:00 до 13:00.

Уровень всасывания глюкозы в тонкой кишке у всех животных (опытных и контрольных) оценивали через 3, 10 и 16 дней от начала опытов со стрессом в интервале 10:00 и 15:00 ч (в период неактивной фазы питания у крыс). В эти же сроки (по окончании опыта с регистрацией потребления глюкозы) у части опытных и контрольных животных после их декапитации отбирались пробы слизистой оболочки из различных отделов тонкой кишки для определения в них активности пищеварительных ферментов: глюкоамилазы (НФ 3.2.1.3), щелочной фосфатазы (НФ 3.1.3.1) и аминопептидазы N (НФ 3.4.11.2) с использованием общепринятых биохимических методов [5]. При этом для каждого фермента рассчитывались значения как удельной (мкмоль/мин на г ткани), так и интегральной активности с учётом массы слизистой оболочки (мкмоль/мин на участок тонкой кишки или мкмоль/мин на всю кишку). Поскольку при разных вариантах расчётов наблюдались близкие закономерности в изменении ферментативных активностей, в статье приведены лишь данные в отношении интегральной активности (мкмоль/мин на всю кишку).

Кроме того, у некоторых животных из опытных и контрольных групп (n = 6) в 1-й, 4-й, 10-й и 16-й дни опытов через 30 мин после начала стрессорного воздействия из хвостовой вены отбирались пробы крови для определения в них концентрации кортикостерона. Определение проводилось путем иммуноферментного анализа с использованием набора реагентов «Кортикостерон крыса/мышь-ИФА» фирмы ХЕМА в соответствии с инструкцией, приложенной к набору.

Статистическая обработка результатов проводилась с использованием t-критерия Стъюдента. За достоверные принимались различия при P < 0,05.

Результаты исследования и их обсуждение

В ходе опытов у крыс, подвергавшихся ежедневной иммобилизации, в первые три дня отмечалось небольшое, статистически недостоверное, снижение прироста массы тела по сравнению с контролем (лишение корма без стресса). Однако в дальнейшем прирост массы тела был близким у крыс опытных и контрольных групп. Снижение массы тела у взрослых или набора массы тела у растущих животных под влиянием иммобилизационного стресса наблюдали также другие исследователи [6–8]. В частности, было установлено, что такое снижение массы тела при хроническом иммобилизационном стрессе обусловлено проявлением анорексии [7, 8].

В первый день опытов иммобилизация животных вызывала значительное, статистически достоверное (P < 0,003) повышение уровня кортикостерона в плазме крови по сравнению с контролем (35,06 ± 3,79 мкг/дл против 17,52 ± 2,32 мкг/дл). Однако в дальнейшем наблюдалось существенное снижение этого показателя. Так, на 4-й день уровень кортикостерона в опытной группе крыс составлял 21,39 ± 2,06 мкг/дл, а в контрольной – 8,47 ± 2,06. На 10-й день он был 12,75 ± 1,64 и 10,5 ± 1,52 мкг/дл в опыте и контроле соответственно, а на 16-й день – 10,55 ± 1,63 и 7,1 ± 1,30 мкг/дл в опыте и контроле соответственно. Снижение уровня кортикостерона в крови при хронической иммобилизации крыс наблюдали также другие исследователи [7–9]. Этот феномен свидетельствует о проявлении у животных привыкания к многократно повторяющемуся стрессору. Такой ответ глюкокортикоидов считается адаптивным, поскольку он направлен на снижение действия хронического стресса на энергетический баланс [7–9].

В настоящей работе уровень всасывания глюкозы в тонкой кишке оценивался, как указано выше, по скорости свободного потребления животными концентрированного раствора глюкозы. Эта методика позволила впервые исследовать процесс в условиях, максимально близких к естественным.

Через 3 дня стрессорного воздействия у крыс опытной группы наблюдалось хотя и небольшое, но статистически достоверное (P < 0,05) повышение по сравнению с контролем всасывания глюкозы в тонкой кишке (рис. 1). Однако в дальнейшем (через 10 и 16 дней) этот показатель возвращался к контрольным значениям. Если принять во внимание полученные нами данные в отношении изменения уровня кортикостерона в крови на аналогичных сроках, то можно предположить, что именно этот фактор является наиболее существенным в развитии адаптации системы всасывания глюкозы в тонкой кишке к хроническому умеренному стрессу. Такое предположение подкрепляется также другими нашими данными, полученными в предшествующей работе [10], которые свидетельствуют о том, что стимулирующие эффекты кортикостерона в отношении всасывания глюкозы в тонкой кишке зависят от дозы вводимого гормона.

Наши результаты сложно сравнивать с данными других авторов, которые в своих исследованиях использовали другие модели хронического стресса и другие подходы к определению всасывательной способности тонкой кишки к глюкозе. Тем не менее в отношении характера ответа системы всасывания глюкозы (повышение всасывания) они согласуются с данными, полученными ранее [6], которые демонстрируют повышение экспрессии одного из основных транспортёров глюкозы (SGLT1) в энтероцитах тонкой кишки в ответ на стресс, вызванный ограничением подвижности животных в течение 4 ч ежедневно, в течение 5 дней в неделю на протяжении 8 недель. Кроме того, в литературе имеются данные об увеличении всасывания глюкозы в тонкой кишке в условиях in vitro и повышении экспрессии двух основных транспортёров глюкозы (SGLT1 и GLUT2) в энтероцитах в ответ на хронический психологический стресс [11].

В настоящем исследовании определялись активности трёх кишечных мембранных ферментов, различающихся по функциональной специализации:

1) глюкоамилазы – ключевой карбогидразы, которая участвует в гидролизе α-декстринов, образующихся после расщепления крахмала панкреатической α-амилазой;

2) щелочной фосфатазы, которая выполняет, помимо участия в гидролизе эфиров фосфорной кислоты и в регуляции всасывания липидов [12], также важные защитные функции (участвует в детоксикации бактериального липополисахарида, в снижении воспаления, вызванного этим токсином, а также в ограничении бактериальной транслокации, через эпителий кишечника [13];

3) аминопептидазы N, расщепляющей олигопептиды, и вовлеченной также в транспорт холестерина через кишечный эпителий [14] и в иммунные ответы [15].

Как можно видеть на рис. 2, через три дня стрессорного воздействия активность глюкоамилазы в слизистой оболочке тонкой кишки у крыс опытной группы была повышена на 69 % по сравнению с контролем (P < 0,05), но на более длительных сроках (через 10 и 16 дней) не отличалась от контрольных значений.

grom1.tif

Рис. 1. Скорость свободного потребления концентрированного (200 г/л) раствора глюкозы у контрольных (Контроль) и опытных (Стресс) крыс. По вертикали: скорость потребления глюкозы в % к соответствующему контролю; по горизонтали: время от начала опытов (дни). *P < 0,05 по отношению к контролю

grom2.tif

Рис. 2. Активности глюкоамилазы (ГА), щелочной фосфатазы (ЩФ) и аминопептидазы N (АП-N) в различные дни стрессорного воздействия и в контроле. По вертикали: ферментативная активность в % к контролю, принятому за 100; *P < 0,05 по отношению к контролю

Поскольку развитие адаптации этой ферментативной активности к хроническому умеренному стрессу происходило примерно так же, как и при всасывании глюкозы, можно предположить, что и в данном случае наиболее существенным фактором в уменьшении реакции со стороны активности фермента являлось снижение концентрации кортикостерона в крови.

Несколько иные особенности развития адаптации наблюдались в отношении двух других ферментов: щелочной фосфатазы и аминопептидазы N (рис. 2). Активность щелочной фосфатазы в тонкой кишке у крыс опытной группы повышалась на 78 % по сравнению с контролем (P < 0,05) через 3 дня, несколько снижалась через 10 дней (оставаясь выше, чем в контроле) и не отличалась от контроля в конце экспериментального периода (через 16 дней). В то же время активность аминопептидазы N в тонкой кишке у крыс опытной группы, будучи повышенной через 3 дня (на 37 % по сравнению с контролем, P < 0,05), лишь незначительно снижалась к концу экспериментального периода.

Учитывая то, что эти ферменты, помимо участия в пищеварении, выполняют также важные защитные функции, можно думать, что активация данных функций может влиять на скорость адаптации указанных ферментов к хроническому умеренному стрессу. Принимая во внимание это обстоятельство, можно также предположить, что длительное поддержание на повышенном уровне активности аминопептидазы N в слизистой оболочке тонкой кишки может быть одним из факторов, вносящих вклад в формирование таких неблагоприятных для организма последствий, как повышение уровня холестерина в крови и развитие воспалительного процесса в кишечнике, обусловленного повышенным проникновением через кишечный эпителий некоторых вирусов и патогенных бактерий [15].

В современной литературе можно найти лишь ограниченное число работ, касающихся исследования реакции мембранных пищеварительных ферментов в тонкой кишке на хронический умеренный стресс. В частности, как сообщается в недавней работе [11], авторы не обнаружили изменений активности мальтазы и сахаразы, но наблюдали повышение активности лактазы в слизистой оболочке тонкой кишки в ответ на хронический психологический стресс. Полученные в настоящей работе результаты частично восполняют пробел в данной области исследований, показывая особенности адаптации к хроническому умеренному стрессу таких мембранных пищеварительных ферментов, как глюкоамилаза, щелочная фосфатаза и аминопептидаза N.

Заключение

Таким образом, в ходе нашего исследования показано, что адаптация к хроническому умеренному стрессу, вызванному иммобилизацией животных, по-разному проявляется в отношении различных функциональных показателей тонкой кишки. Способность тонкой кишки к всасыванию глюкозы и активность глюкоамилазы (ключевой фермент при гидролизе углеводов) изменяются лишь в начальный период (через 3 дня) хронического умеренного стресса, а в дальнейшем не отличаются от контроля, тогда как адаптация щелочной фосфатазы и аминопептидазы N (ферменты, которые выполняют, помимо участия в гидролизе жиров и белков, важные защитные функции) к вышеуказанному стресс-фактору происходит в течение более длительного времени.