Значимость проблемы нозокомиальных инфекций и инфицирования имплантируемых устройств и систем медицинского назначения в настоящее время бесспорна: проблема инфицирования области хирургического вмешательства и имплантатов медицинского назначения в клинической практике ежегодно приобретает всё большие масштабы, даже несмотря на применение антибиотиков из групп гликопептидов и липопептидов. Ситуация такова, что из-за появления полирезистентных штаммов патогенных микроорганизмов по всему миру всё чаще приходится сталкиваться со штаммами бактерий, против которых или нет эффективного антибиотика или же для эффективного лечения пригоден лишь один класс антибиотиков [1]. Одной из причин этого является также и наличие бактериальных биопленок, существенно осложняющих проникновение многих антибиотиков к мишеням и значительно повышающих адаптационные возможности бактерий к новым условиям. Надо отметить, что бактериальной колонизации могут быть подвержены любые виды хирургических имплантатов, независимо от материала – будь то металлические либо полимерные, что заставляет, помимо доступных ныне в клинической практике методов, искать также и новые, в том числе неспецифические, способы воздействия на патогенные микроорганизмы.
Появление к настоящему времени все большего количества сведений о регуляции бактериальной адгезии, вирулентности и формировании биопленок, бактериальных межклеточных сигналов и механизмах энергетического обмена и биохимических реакций в клетках бактерий привело к расширению понимания дальнейшей стратегии и смещению акцентов в сторону превентивных мер, направленных в первую очередь на предупреждение колонизации имплантируемых устройств и систем патогенными микроорганизмами, нарушению формирования либо непосредственному повреждению биопленок с блокированием систем межмикробных взаимодействий и дестабилизации систем поддержания гомеостаза патогенной микробиоты [2].
Существующие на сегодняшний день экспериментальные исследовательские направления по предотвращению бактериальных инфекций можно условно классифицировать на следующие:
1. Предотвращение адгезии бактерий к защищаемой поверхности.
2. Разрушение бактериальной клеточной стенки и нарушение внутреннего гомеостаза бактерий; повреждение систем, отвечающих за поддержание гомеостаза.
3. Нарушение механизмов обмена бактериальными межклеточными сигналами.
4. Разрушение биофильма либо его компонентов.
5. Лизирование бактерий при помощи естественных биологических агентов.
В настоящем литературном обзоре будут рассмотрены первые два направления: предотвращение адгезии к защищаемой поверхности, а также разрушение бактериальной клеточной стенки с нарушением/повреждением систем поддержания внутреннего гомеостаза бактерий.
Предотвращение адгезии бактерий к поверхностям
Поскольку одной из ключевых экологических стратегий существования бактерий является их фиксация к твердым субстратам, наряду с образованием колоний, то на этапах филогенеза микроорганизмы сформировали развитый адаптивный механизм регуляции и реализации процесса адгезии к различным субстратам и поверхностям.
Бактерии обладают многочисленными комплексными механизмами адгезии, которые различаются у различных штаммов, и могут обладать быстрой изменчивостью в ходе мутаций в пределах даже одного штамма или под воздействием внешних стимулов, таких как достаточность ресурсов для питания либо скорость потока жидкости в среде [3].
Непосредственно адгезия регулируется путем экспрессии функциональных генов, отвечающих за формирование на поверхности бактериальной клетки необходимых для процесса адгезии макромолекулярных структур. Поверхность бактериальных клеток снабжена огромным количеством поверхностных связывающих молекул к различным белковым структурам внеклеточного матрикса макроорганизма-хозяина, таким как фибронектин, фибриноген, витронектин, эластин и ряду других, что позволяет рассматривать указанные матричные молекулы на поверхности клеток бактерий как единый комплекс, более известный как бактериальная система распознавания матричных молекул адгезии MSCRAMMs (microbial surface component recognizing adhesive matrix molecules), который играет одну из главенствующих ролей на этапе адгезии бактерии к поверхностям клеток макроорганизма [4]. Фактически, если упростить ситуацию до минимума, то различные варианты взаимодействия бактерий с внешней средой опосредованы химическими и физическими стимулами извне в ходе контактов с окружающими клетками и тканями, а также объектами неживой природы.
Дополнительными факторами, определяющими процесс адгезии микроорганизмов, являются поверхностный заряд клеточной мембраны, её гидрофобность, структура поверхностной мембраны и её экзополисахариды, а также возможное наличие жгутиков (пили) – последнее характерно для грамотрицательных микроорганизмов, хотя в определенных случаях преимущество, предоставляемое наличием жгутиков, варьирует в зависимости от штамма бактерий и условий роста колонии [5].
Необходимо также кратко упомянуть и то, что ряд используемых в медицинской отрасли материалов, в частности – некоторые металлы, совершенно не обладают антибактериальными свойствами в отношении наиболее распространенных грамположительных и грамотрицательных микроорганизмов [6], что способствует быстрой колонизации имплантатов на их основе.
С учетом вышесказанного в настоящее время сформировались два основных направления борьбы с бактериальной адгезией к защищаемым поверхностям: обработка защищаемых поверхностей антибактериальными агентами различной природы либо воздействие непосредственно на сами процессы генной регуляции факторов адгезии бактерий.
В первом случае предложено значительное количество способов защиты: фиксация на поверхности защищаемого объекта агентов, обладающих бактерицидным либо бактериостатическим действием, в качестве которого могут выступать катионы металлов, в частности – ионы меди [7, 8], наночастицы серебра и покрытия на их основе [9,10], формирование на поверхности защищаемых объектов полиэлектролитных многослойных покрытий, электрический заряд на поверхности которых препятствует адгезии [11], и даже многослойные покрытия из углеродных нанотрубок с заключенными в их слоях ферментами, в частности лизоцимом [12]. Тем не менее большая часть из этих методов пока еще не выходит за пределы исследовательских лабораторий, но даже по завершении всех необходимых испытаний предлагаемые методы могут занять лишь весьма узкую нишу в медицинской отрасли. В частности, применение различного рода покрытий в имплантируемых устройствах и системах сопряжено с их механическим соскабливанием непосредственно в процессе имплантации, например, в ортопедии, что может свести к минимуму эффективность такого подхода к профилактике колонизации имплантата. Более того, известны факты выработки устойчивости к самим антибактериальным агентам, в частности показано формирование устойчивости к серебру у ряда штаммов Pseudomonas aeruginosa и Acinetobacter baumannii [13], причем есть веские основания полагать, что эта устойчивость была опосредована за счет наличия соответствующих плазмидных генов (pUPI199), которую в эксперименте этих же авторов удалось успешно воспроизвести и у Escherichia coli после объединения с плазмидной ДНК. Учитывая то, что плазмидными генами может кодироваться как устойчивость к серебру, так и к антибиотикам, некоторые авторы рекомендуют использовать медицинские изделия с высоким содержанием ионов серебра для быстрого достижения желаемого эффекта [14], однако безвредность ионов серебра для собственных тканей макроорганизма в таком случае вызывает определенные сомнения. В частности, контакт с костной тканью серебра, иногда входящего в состав ряда ортопедических имплантатов, тормозит процессы остеогенеза [15] и способно вызывать остеолиз, что совершенно неприемлемо и может привести к серьезным последствиям. Показана также токсичность ионов серебра с крупным размером частиц – свыше 100 нм [16] и накопление частиц серебра в тканях мозга мышей, подвергнутых прямой инокуляции частиц серебра микронных размеров, с последующим образованием полостей в тканях и воспалительным процессом вокруг этих металлочастиц, сопровождающимся увеличением содержания провоспалительных цитокинов (в частности, фактор некроза опухоли-альфа) и связывающего металлические ионы металлотионеина, прогрессирующей утратой мозгового вещества (коры и гиппокампа) и увеличением боковых желудочков мозга [17].
Принципиально отличным способом от вышеописанного является воздействие на механизмы генной регуляции адгезии микроорганизмов. К настоящему моменту имеется достаточное количество свидетельств того, что создание нокаутных штаммов микроорганизмов и выработка антител к соответствующим регуляторным молекулам позволяет предотвратить процесс адгезии путем выключения передачи сигнального стимула, что открыло путь к созданию противоадгезивных вакцин [18]. Указанный подход позволил создать экспериментальные вакцины против фибриногенсвязывающего белка, фибронектинсвязывающего белка А и агглютинина A [19, 20].
В рамках этого направления можно выделить также следующие точки приложения для потенциальных противоадгезивных вакцин, действующих на механизмы биосборки адгезивных полимерных структур (пилей и ворсинок) – процесса, который на сегодняшний день уже достаточно хорошо охарактеризован и изучен [21]:
1. Ингибирование формирования шаперон-структурной субъединицы.
2. Торможение процесса полимеризации на этапе взаимодействий шаперон-структурной субъединицы с белком, отвечающим за её транслокацию из периплазмы через внешнюю мембрану.
3. Ингибирование при помощи антиадгезиновых антител прикрепления бактерий к рецепторам, расположенным на поверхности клеток хозяина.
Это стало возможным благодаря тому, что шапероны представляют собой высококонсервативную группу белков, играющих ключевую роль в процессах биогенеза адгезивных структур, что привело к созданию целой группы антибактериальных агентов – пилицидов, которые блокируют образование шаперон-структурной субъединицы путем специфичного и прочного связывания с шаперонами, препятствуя их взаимодействию с субъединицей. Некоторые пилициды обладают возможностью вызывать диссоциацию шаперон-структурной субъединицы, что гарантирует эффективное ингибирование образования адгезивных структур [21].
Тем не менее в том случае, если адгезия все-таки произошла, следующим рубежом вслед за средствами предотвращения адгезии следуют агенты, оказывающие непосредственное действие на сами микроорганизмы либо на формируемые ими биопленки, о чем пойдет речь далее.
Разрушение бактериальной клеточной стенки и нарушение внутреннего гомеостаза бактерий
Несмотря на наличие у бактерий достаточно эффективной защиты в виде биопленок, сама клеточная стенка и цитоплазма с её включениями достаточно уязвимы для внешних воздействий, что послужило основой для разработки и появления различных классов веществ, воздействующих на эти мишени.
Фактически общий принцип повреждающего воздействия на бактериальную клетку сводится к перфорации бактериальной стенки и последующему выравниванию осмотического давления между внутренней и внешней средой клетки, деструктивного для последней, либо к повреждению её метаболических процессов или цитоплазматических включений терапевтическим агентом, проникшим в клетку через её ионообменные транспортные механизмы. Поскольку настоящая статья не ставит своей целью рассмотрение механизмов действия различных классов антибиотиков, чему посвящено огромное множество литературных публикаций последних десятилетий, мы остановимся лишь на наиболее современных сведениях о разрабатываемых и перспективных методах непосредственного воздействия на клеточную стенку и цитоплазматические включения бактерий.
Одним из основных факторов противодействия бактерий в отношении различных классов антибиотиков является наличие у бактерий возможности удалять поступившие в них молекулы путем использования механизмов ионообменного трансмембранного транспорта. К настоящему моменту идентифицированы несколько разновидностей ионных эффлюксных насосов, способных удалять из клетки не только какой-либо конкретный антибиотик, но и одновременно несколько различных классов антибиотиков – эффлюксные насосы, обеспечивающие множественную лекарственную устойчивость бактерий к различным антибактериальным препаратам и способные к передаче подобной устойчивости через плазмидные гены [22, 23]. В качестве противодействия подобному защитному механизму были выделены и идентифицированы различные ингибиторы эффлюксных насосов (ИЭН), позволяющие нарушить работу ионообменного транспорта по удалению во внешнюю среду поступивших в клетку терапевтических агентов, что позволило эффективно снизить минимальные подавляющие концентрации для антибиотиков, необходимую для элиминации патогенных микроорганизмов. Так, указанный эффект показан при воздействии на кларитромицин-резистентные штаммы E. coli комбинацией из кларитромицина и ИЭН на основе фенил-аргинин-бета-нафтиламида [24], обработки Mycobacterium smegmatis при помощи фарнезола [23]. Достаточно большое количество ИЭН было обнаружено у растений, естественными патогенами для которых являются грамнегативные бактерии и грибы – так, некоторые растения рода барбариса (Berberis repens, B. aquifolia и B. fremontii) вырабатывают 5′-метоксигиднокарпин – ИЭН для NorA (эффлюксного насоса, обеспечивающего множественную лекарственную устойчивость) у Staphylococcus aureus [25]. Известно также, что растение Artemisia absinthium продуцирует кофеилхинную кислоту, являющуюся ИЭН для грамположительных патогенных бактерий [22].
Помимо ионообменного транспорта, клеточная стенка бактерий содержит еще целый ряд потенциальных мишеней для антибактериальной терапии, в частности – липиды клеточной стенки, которые весьма уязвимы для перекисного окисления, что ведет к её перфорации и последующему осмотическому разрушению бактерии. Непосредственным действием на липиды обладают вещества из группы порфиринов, которые способны реагировать как напрямую с биологическими структурами (реакции первого типа), так и путем катализа пероксидных и оксидазных реакций с последующим образованием активных форм кислорода. Их использование в фотодинамической терапии инфекционных процессов, вызванных грамположительными и грамотрицательными бактериями, достаточно хорошо описано в литературе, наряду со способностью металлопорфиринов увеличивать сенсибилизацию бактерий к свободным радикалам или же непосредственно вызывать их образование [26–28]. В свете вышесказанного об ИЭН существуют также экспериментальные данные, в которых были исследованы комбинации фотодинамической терапии с использованием верапамил гидрохлорида в качестве ИЭН по отношению к биопленке E. faecalis, сформированной на метиленовом синем, продемонстрировавшие эффективность такого подхода для разрушения биофильма, его структуры и находящихся в биофильме бактерий [29].
Одним из перспективных средств воздействия на патогенные микроорганизмы может стать необратимое повреждение нуклеиновых кислот, содержащихся в их ядерном аппарате, под воздействием искусственно синтезированных нуклеаз [30], поскольку идеальной мишенью для инактивации как вирусных, так и бактериальных патогенов является их геномная нуклеиновая кислота, разрушение которой любым методом приведет к потере патогеном способности к репликации и размножению. Результаты применения рибонуклеаз показывают, что они обеспечивают необратимое повреждение ДНК и РНК клеток в эксперименте [31], а также способны воздействовать на биопленку [32], что позволяет надеяться на их возможное применение в клинических условиях как универсального антисептического агента, действующего на вещества белковой природы. Тем не менее остаются нерешенными вопросы, касающиеся биологической безопасности рибонуклеаз для эукариотических клеток макроорганизма, что потребует дополнительного изучения.
Определенный интерес представляет собой возможность влияния на процессы захвата и метаболизма ионов трехвалентного железа, играющего важную роль в обеспечении ферментативных реакций бактерий. Последние обладают широкими возможностями по получению железа при нахождении в колонизированном организме хозяина, даже в условиях дефицита железа, характерного для живых систем, особенно в случае развития воспалительной реакции. Для этого у бактерий есть целый ряд механизмов, включающих использование как свободной формы железа путем её захвата специальными рецепторами на мембране клетки, так и возможность использования для этой цели поринов и сидерофоров [33–35]. В свете этого весьма интересным стал ряд публикаций, посвященных попытке реализации концепции «троянского коня» путем подмены ионов трехвалентного железа на комплексы трехвалентных галлия, индия и скандия, обладающие химическим сходством с трехвалентным железом, но не участвующие в окислительно-восстановительных реакциях бактериальных клеток, тем самым ингибируя их осуществление в клетке, захватившей эти ионы вместо ионов железа [2, 36, 37]. Есть ряд работ, посвященных ингибированию роста Ps. aeruginosa наряду с биопленкой, формируемой этим микроорганизмом, в которых показаны различные пути доставки галлия в бактериальную клетку – использующие нитрит галлия Ga(NO3)3 [2] и соединение дезферриоксамина с галлием [38]. В последнем случае хоть и не был установлен механизм действия антибактериального агента, тем не менее желаемый эффект был достигнут – было отмечено подавление инфекционного процесса, вызванного Ps. aeruginosa при моделировании in vivo.
Нарушение работы механизмов систем межмикробных взаимодействий
Изучение механизмов сигнальных взаимодействий бактерий между собой является крайне важным для понимания процессов адгезии бактерий к субстрату, формирования колоний и регуляции её численности. За сигнальное обеспечение этих процессов у бактерий отвечают специфические секретируемые молекулы – автоиндукторы, а сам механизм называется «quorum sensing» или система межмикробных взаимодействий [39]. Данная система представляет собой способ межклеточных бактериальных коммуникаций, зависящий от плотности клеток на единицу объема, вовлеченный в экспрессию генов (в т.ч. генов вирулентности для экзоэнзимов, экзополисахаридов) и связанными с этим изменениями в поведении бактерий, находящихся в биопленке, включая их сопротивляемость к изменяющимся условиям внешней среды при большой плотности бактериальной колонии [39–41]. Основные известные на сегодня системы межмикробных взаимодействий описаны как система белковых рецепторов LuxR-LuxI у грамотрицательных бактерий, которая использует N-ацил-гомосеринлактон в качестве сигнальной молекулы и сигнальные системы agr/fsr, использующие РНКIII в качестве эффекторных молекул. Как в грамотрицательных, так и в грамположительных бактериях системы межмикробных взаимодействий регулируют экспрессию механизмов адгезии (биопленка и адгезины) и факторов вирулентности (токсины и экзоэнзимы) в зависимости от плотности колонии бактерий [39, 42].
Разумеется, широта влияния этих систем на функциональную активность бактерий, в том числе способность к адгезии и формированию биопленок, привлекает значительный интерес с позиции поиска агентов, нарушающих работу этой системы – ингибиторов систем межмикробных взаимодействий, а также попытки создать антимикробные средства, выключающие указанные системы и нарушающие их работу.
Ряд идентифицированных к настоящему моменту таких ингибиторов представляют собой вещества, продуцируемые растениями в качестве неспецифического средства защиты против бактериальной колонизации, хотя есть и искусственно синтезированные вещества [41, 43], и даже выделенные непосредственно из числа продуцируемых самими бактериями – в частности, фенэтиламид и циклический дипептид [44]. Ho KK et al. [43] в своей работе показали, что 5-метилен-1-(проп-2-эноил)-4-фенил-дигидропиррол-2-1 способен предотвращать формирование биопленки Pseudomonas aeruginosa и Staphylococcus aureus при его использовании в качестве компонента искусственного защитного покрытия в модельном эксперименте.
Значительное количество экспериментальных работ было посвящено изучению веществ, блокирующих те или иные звенья систем межмикробных взаимодействий, что достаточно хорошо описано в обзорных литературных публикациях последних лет [45–47] но несмотря на это ни один из ингибиторов систем межмикробных взаимодействий, опробованных на модельных животных, ещё пока непригоден для применения у человека [48], наряду с уже описанным в литературе возможным появлением устойчивости бактерий к некоторым таким ингибиторам либо появлением устойчивых штаммов бактерий, которые путем давления отбора могут заменить собой уязвимые к ингибиторам штаммы [49]. Тем не менее, это направление научного поиска (поиск и селекция ингибиторов систем межмикробных взаимодействий) является стабильно интересным с точки зрения возможных перспективных методов предотвращения развития инфекционного процесса у человека, поскольку подобные агенты являются весьма многообещающей альтернативой антибиотикам либо средством для потенцирования их эффекта за счет синергетического действия антибиотика и ингибитора.
Заключение
Настоящий краткий обзор литературы освещает лишь часть из широкого арсенала перспективных средств воздействия на патогенные бактерии и их колонии, а также демонстрирует необходимость постоянного дальнейшего поиска механизмов контроля бактериальной колонизации имплантируемых устройств и систем медицинского назначения, поскольку бактериальные инфекции представляют собой одну из серьезнейших проблем в современной медицине и медицине будущего, в связи с чем усилия исследователей должны концентрироваться на целом ряде направлений, максимально полно охватывающих широкий диапазон уязвимостей бактерий и их колоний.