Исследования лекарственных растений, применяемых в народной медицине, представляют практический интерес для современной фармации во всем мире. Наличие в растительном сырье различных химических веществ, проявляющих в организме животного и человека биологическую активность, обусловливают его лечебное действие.
Установление фармакологической активности таких растений для применения в медицинской практике предваряет целый комплекс исследований.
Изучение фармакологических свойств и химического состава растительного сырья способствует также созданию новых современных высокоэффективных лекарственных средств. Опыт использования пыльцы сосны обыкновенной в народной медицине доказывает относительную безопасность, отсутствие противопоказаний и побочных эффектов, наравне с уникальным оздоровлением организма и излечением многих заболеваний. С другой стороны, в России отсутствуют данные исследований состава биологически активных веществ пыльцы сосны обыкновенной (Pinus sylvestris L.).
В рамках выполнения государственного задания, комплексной темы кафедры фармации Северо-Осетинской медицинской академии за период 2013–2017 гг. были проведены следующие исследования пыльцы сосны обыкновенной (Pinus sylvestris L.):
– макро- и микроскопическое изучение;
– определение товароведческих показателей;
– изучение элементного состава пыльцы сосны обыкновенной;
– определение острой и хронической токсичности;
– количественное определение флавоноидов;
– изучение кислоты аскорбиновой.
Аминокислоты как основные составные части белков, наряду с нуклеиновыми кислотами, углеводами и липидами, участвуют во всех жизненных процессах. Однако, в отличие от растений, организм человека в основном не способен синтезировать такие незаменимые аминокислоты, дефицит которых возможно восполнять как растительной пищей, так и лечебными препаратами из растительного сырья.
Данные исследования по изучению качественного и количественного состава аминокислот в лекарственном растительном сырье вызывают научный интерес и имеют практическое значение [1–4].
Цель исследования – изучение аминокислотного состава пыльцы сосны обыкновенной (Pinus sylvestris L.), произрастающей на территории РСО-Алания, современными физико-химическими методами.
Материалы и методы исследования
Объектом исследования послужила пыльца сосны обыкновенной (Pinus sylvestris L.), произрастающей на территории РСО-Алания, заготовленная в мае 2016 г. в период цветения. Заготавливали только мужские нераскрытые соцветия с пыльцой (пыльники), расположенные в основании молодых побегов.
Качественное определение аминокислот в пыльце сосны обыкновенной проводилось на базе лаборатории фармацевтического и токсикологического анализа кафедры фармации СОГМА в 2016 г. С целью качественного определения аминокислот в пыльце сосны обыкновенной были использованы различные реакции идентификации аминокислот [1].
Количественное определение аминокислотного состава пыльцы сосны обыкновенной проводили на аминокислотном анализаторе – ААА 400 производства ИНГОС Чехия, автоматизированном жидкостном хроматографе с компьютерным управлением [5–6].
Все расчеты проводились методом абсолютной градуировки хроматографических пиков.
Элюат смешивался с нингидриновым реагентом и вступал в реакцию в проточной ячейке реактора при t = 121°С.
Неподвижная фаза (смола) – для аминокислотного анализа использовали сильнокислые ионообменные смолы.
Подвижная фаза (элюент) – растворы, отвечающие за хроматографическое разделение, включали элюционные буферы и регенерант.
Другие растворы, называемые загрузочными буферами, использовались для приготовления образца и разбавления (табл. 1).
Буферы для аминокислотного анализа состояли из ингредиентов двух типов. Главные ингредиенты управляют хроматографической средой, а вспомогательные предохраняют от окисления и бактериального заражения. Желаемая кислотность и ионная сила буферов создавалась при помощи следующих основных ингредиентов: лимонная кислота; натрий или литий цитрат; натрий или литий хлорид.
Два других компонента являлись частями натриевого буфера № 4 (рН ~ 8):
– концентрированный раствор NaOH (50 % = 12,5М) используется для подводки буфера с целью получения оптимального разделения аминокислот;
– борная кислота (для компенсации потерь буферной способности цитратного буфера в заданном рН диапазоне).
В качестве вспомогательных ингредиентов использовались тиодигликоль как антиоксидант и азид натрия как консервант.
Подготовленные образцы перед введением их в анализатор отвечали следующим требованиям:
– значение рН как можно ближе к 2,20,
– постоянная ионная сила в течение всей последовательности цикла,
– концентрация аминокислот достаточна для детектирования (0,2 – 1,5 AU (значения y-оси хроматограммы)),
– отсутствие белка, микроорганизмов, взвешенных частиц,
– оптимальное разведение загрузочным буфером (с минимальным содержанием органики) [4].
Методика. В пенициллиновый флакон на 20 мл вносили 0,2 г образца – пыльцы сосны обыкновенной (точная навеска на аналитических весах), затем доливали до верха 6 нормальной кислотой хлористоводородной, ставили на 23 часа в сушильный шкаф с закрытой крышкой. Устанавливали температуру t = 110 °С. По окончании гидролиза охлаждали до комнатной температуры с последующим выпариванием досуха в ротационном испарителе, после чего добавляли 5 мл Н2О и повторно выпаривали (промывание водой необходимо, данную манипуляцию проделывали два раза). К выпаренному досуха образцу приливали 50 мл загрузочного буфера (рН – 2,2). Перед вводом в ионообменную колонку образец пыльцы обыкновенной фильтровали через бумажный фильтр – синяя лента (табл. 2) [1–3].
Условия аминокислотного анализа смеси:
– использовали ступенчатый градиент;
– скорость потока буферных растворов 0,3 мл/мин;
– скорость потока нингидринового реактива 0,2 мл/мин;
– детектирование в УФ областях 440 и 570 нм;
– температуры термостата реактора – 121 °С.
Таблица 1
Растворы, используемые в ионообменной хроматографии аминокислот
|
Раствор |
Применение |
|
|
Загрузочный буфер |
Подготовка и разбавление образцов, самый кислый буфер (0,2М, рН 2,2). |
|
|
Элюанты |
Элюционные буферы |
Буферы используются для создания градиента рН и ионной силы для уравновешивания колонки и элюант-образца |
|
Регенерант |
Сильно щелочной раствор гидроксида, применяемый для удаления всех остатков образца из колонки |
|
Аминограмма пыльцы сосны обыкновенной (Pinus sylvestris L.), выданная прибором – ААА 40
Таблица 2
Программа работы аминокислотного анализатора для определения количественного содержания аминокислот в исследуемом образце пыльцы сосны
|
Время, мин |
Температура колонки |
Номер раствора буферного |
Команды |
|
0 |
55 |
1 |
Ввод образца в колонку |
|
5 |
55 |
1 |
Обнуление линии детектора |
|
12 |
55 |
2 |
– |
|
40 |
55 |
3 |
– |
|
52 |
55 |
4 |
– |
|
68 |
74 |
4 |
– |
|
76 |
74 |
4 |
Регенерация колонки |
|
78 |
74 |
6 |
– |
|
88 |
74 |
1 |
Вместо нингидрина подача воды |
|
93 |
55 |
1 |
– |
|
100 |
55 |
1 |
Загрузка образца в петлю и ожидание ввода в колонку |
|
101 |
55 |
1 |
Включает подачу нингидринового реактива в реактор |
|
107 |
55 |
1 |
Окончание и сохранение аминограммы |
Заданные количества стандартного и испытуемого раствора через дозировочную петлю (100 мкл) вводили в колонку аминокислотного анализатора, после чего прибором рассчитывали площади пиков испытуемого и стандартного растворов и по формуле проводили расчет концентрации каждой аминокислоты в процентном соотношении (рисунок).
Результаты исследования и их обсуждение
Результаты качественного определения аминокислот в пыльце сосны обыкновенной (Pinus sylvestris L.) отражены в табл. 3.
Таблица 3
Качественные реакции на аминокислоты в пыльце сосны обыкновенной (Pinus sylvestris L.)
|
№ п/п |
Наименование реакции |
Результат реакции |
|
1 |
Биуретовая реакция |
сине-фиолетовая окраска |
|
2 |
Нингидриновая реакция |
фиолетово-синяя окраска |
|
3 |
Ксантопротеиновая реакция |
желтое окрашивание |
|
4 |
Реакция Сакагучи |
оранжево-красное окрашивание |
|
5 |
Нитропруссидная реакция |
пурпурное окрашивание |
|
6 |
Реакция Паули |
вишнево-красное окрашивание |
Необходимо отметить положительные результаты проведенных качественных реакций, обусловленных специфичностью данных реакций, что дает возможность использовать их в дальнейших исследованиях по разработке методик качественного обнаружения аминокислот в пыльце сосны обыкновенной (Pinus sylvestris L.).
Результаты оценки количественного аминокислотного состава пыльцы сосны обыкновенной представлены в табл. 4.
Таблица 4
Содержание аминокислот в пыльце сосны обыкновенной (Pinus sylvestris L.)
|
№ п/п |
Наименование аминокислоты |
Содержание в образце, % |
|
1 |
Аспарагиновая кислота (Аsp) |
1,23 |
|
2 |
Треонин (Тhr) |
0,50 |
|
3 |
Серин (Ser) |
0,61 |
|
4 |
Глютаминовая кислота (Glu) |
1,73 |
|
5 |
Пролин (Pro) |
0,95 |
|
6 |
Глицин (Gly) |
0,58 |
|
7 |
Аланин (Ala) |
0,68 |
|
8 |
Валин (Val) |
0,56 |
|
9 |
Метионин (Met) |
0,17 |
|
10 |
Изолейцин (Iie) |
0,44 |
|
11 |
Лейцин (Leu) |
0,84 |
|
12 |
Тирозин (Tyr) |
0,60 |
|
13 |
Фенилаланин (Phe) |
0,51 |
|
14 |
Гистидин (His) |
0,34 |
|
15 |
Лизин (Lys) |
0,87 |
|
16 |
Аргинин (Arg) |
1,51 |
|
Сумма аминокислот, % |
12,14 |
|
|
Сырой протеин, % |
15,02 |
|
|
Содержание незаменимых аминокислот, % |
37,88 |
|
Таким образом, в исследуемом образце пыльцы сосны обыкновенной (Pinus sylvestris L.), произрастающей и собранной на территории РСО-Алания, выявлено 16 аминокислот, из которых девять незаменимые: треонин, валин, метионин, изолейцин, лейцин, фенилаланин, гистидин, лизин и аргинин. Установлено содержание суммы аминокислот исследуемого сырья в объеме 12,14 %.
Содержание незаменимых аминокислот в исследуемом образце от общего числа составляет 37,88 %.
В результате оценки аминокислотного состава пыльцы сосны обыкновенной (Pinus sylvestris L.) в порядке убывания выявлено преобладание глютаминовой кислоты, аспарагиновой кислоты и аргинина. Наибольшее количество составила кислота глютаминовая (1,73 %), которая играет важную роль в азотистом обмене.
Выводы
Полученные результаты исследований пыльцы сосны обыкновенной (Pinus sylvestris L.) могут являться предварительным обоснованием дальнейших разработок лекарственных средств, обладающих эффективным ноотропным действием ввиду наличия глютаминовой кислоты, психостимулирующим и мягким антидепрессивным действием ввиду наличия аспарагиновой кислоты, дезинтоксикационным действием ввиду наличия аргинина, кардиостимулирующим действием ввиду наличия пролина.
Итоги проведенных исследований также дополняют ранее полученные сведения о составе пыльцы сосны обыкновенной (Pinus sylvestris L.) и могут быть использованы при дальнейшей разработке новых лекарственных средств из данного лекарственного сырья.