Scientific journal

International Journal of Applied and fundamental research

ISSN 1996-3955

ИФ РИНЦ = 0,593

Известно, что многоядерные клетки макрофагального происхождения участвуют в формировании гранулем [1; 2], имеющих значение в патогенезе туберкулезного гранулематоза [3]. Изучены различные аспекты образования гранулем при туберкулезном гранулематозе [3] и обсуждаются проблемы формирования [1; 4] и функционирования многоядерных макрофагальных производных [2; 4]. В то же время не вызывает сомнения тот факт, что численный состав популяции многоядерных макрофагов (МФ) обусловлен интенсивностью процессов формирования [1] и апоптоза данных клеток [2]. В этой связи изучение проблемы апоптоза многоядерных МФ [2] представляет интерес в том плане, что с апоптозом связан механизм элиминации многоядерных клеток в очаге хронического воспаления [5] и это детерминирует изменение клеточного состава последнего.

Описана также динамика изменения клеточного состава БЦЖ-гранулем в процессе развития хронического гранулематозного воспаления [3]. Однако по-прежнему к категории малоизученных вопросов относится динамика реализации апоптоза многоядерных МФ в зависимости от характера влияния проапоптогенных и антиапоптотических факторов, в том числе экспрессируемых самими многоядерными МФ, что обусловливает особенности развития процесса хронического воспаления при туберкулезном гранулематозе.

Далее следует указать, что кроме маркеров апоптоза, какими являются Caspasa-3 и белок p53 [6], экспрессия которых, несомненно, свидетельствует об его индукции [7], небезынтересна роль цитокинов в реализации процесса апоптоза [5; 8]. В частности, следует заметить, что TNF-α индуцирует процесс апоптоза МФ, в то время как IL-4 подавляет их апоптоз [5]. При этом TNF-α обладает весьма сложными функциями и его роль во многом остается малоизученной [9], однако показано его участие в регуляции апоптоза [10].

В то время как учет экспрессии белка Bcl-2 информативен в качестве метода оценки степени ингибирования апоптоза [7], поскольку Bcl-2 является антиапоптотическим фактором [11]. Изучение механизмов действия белков семейства Bcl-2 способствует пониманию их функций в регуляции процесса апоптоза [12]. Существует также Bcl-2-ассоциированный промоутер клеточной гибели белок Bad [13]. При этом известно, что наряду с белком Bad [12] некоторые другие протеины, в частности Bax [11; 12], Bak и Bik, относятся к промоутерам апоптоза [12]. Тем не менее именно белок Bad, причисляемый к Bcl-2-ассоциированным промоутерам клеточной гибели [13], заслуживает наибольшего внимания в плане совместной оценки интенсивности его экспрессии с протеином Bcl-2, детектирование которого, как уже было отмечено, информативно при определении степени ингибирования апоптоза [7].

В связи с вышеизложенным представляется целесообразным изучение аспектов реализации апоптоза многоядерных МФ, имеющих значение в развитии хронического туберкулезного гранулематозного воспаления, и уточнение роли многоядерных макрофагальных производных в экспрессии проапоптогенных и антиапоптотических факторов, обусловливающих степень интенсивности процесса апоптоза МФ, что определяет клеточный состав гранулем.

Целью работы являлось изучение в популяциях одноядерных и многоядерных МФ в первичных культурах перитонеальных клеток (ПК) интактных и БЦЖ-инфицированных мышей динамики экспрессии проапоптогенных (Bad) и антиапоптотических (Bcl-2) белков-регуляторов, обусловливающих специфику реализации апоптоза.

Материалы и методы исследования

Эксперименты проводили in vitro на клетках перитонеального транссудата мышей-самцов линии BALB/c возрастом 2 месяца. При реализации исследования использовали контрольную группу культур ПК, выделенных от интактных животных, и опытные группы культур ПК, выделенных от животных инфицированных микобактериями вакцины БЦЖ (МБ БЦЖ). Выведение животных из эксперимента осуществляли через 1 и 3 месяца после введения им вакцины БЦЖ. Причем на 3-месячный срок наблюдения отмечается формирование типичных БЦЖ-гранулем [3]. Вакцину БЦЖ вводили внутрибрюшинно в дозе 0,5 мг в 0,25 мл изотонического водного раствора NaCl.

Суспензию ПК получали после выведения животных из эксперимента методом дислокации шейных позвонков под эфирным наркозом. Инкубацию культур ПК (106 клеток в 2 мл среды 199, содержащей 10 % сыворотки крови эмбрионов коров) проводили на покровных стеклах в течение 48 часов в пластиковых планшетах для культуральных исследований. Культуры ПК фиксировали 4 % водным раствором формальдегида, приготовленным на фосфатном буфере.

При использовании методов световой микроскопии в культурах ПК оценивали частоту встречаемости клеток в субпопуляциях одноядерных, бинуклеарных и содержащих 3 и более ядер перитонеальных МФ. Цитологический анализ клеточных культур осуществляли при увеличении в 400 раз, используя микроскоп «Axiostar Plus» («Zeiss»). Поскольку (сообразуясь с целью настоящего исследования) была необходима оценка экспрессии проапоптотических и антиапоптотических белков, учитывали численный состав субпопуляций, разнящихся по классам ядерности МФ, экспрессирующих соответствующие факторы. В ходе реализации иммуноцитохимических исследований определяли экспрессию у МФ проапоптогенных (Bad) и антиапоптотических (Bcl-2) белков-регуляторов непрямым иммуноцитохимическим методом с использованием системы визуализации на основе биотин-стрептавидин-пероксидазного комплекса «BD Pharmingen» Anti-Rat Ig HRP Detection Kit и диагностических наборов моноклональных антител «Novocastra». Проводили демаскировку исследуемых факторов 0,3 % раствором Тритона Х-100, приготовленным на фосфатном буфере. Иммуноцитохимическими признаками экспрессии у МФ белков Bad и Bcl-2 считали наличие окраски цитоплазмы в светло-коричневый цвет. При этом определяли долю МФ с указанными классами ядерности, обладающих признаками экспрессии отмеченных факторов.

При статистической обработке результатов анализа проводили оценку вероятности достоверности различий между сравниваемыми средними величинами при учете непараметрического критерия Манна – Уитни с использованием компьютерной программы «Statistica 8». Данные были представлены в виде средней арифметической и ее стандартной ошибки (M ± m). При этом различия между сравниваемыми средними величинами считали достоверными при p < 0,05.

Результаты исследования и их обсуждение

Согласно результатам проведенного исследования в интактных культурах ПК численность одноядерных МФ с признаками экспрессии белков Bcl-2 и Bad составляла около 1 %, тогда как у бинуклеарных и собственно многоядерных МФ экспрессия указанных факторов практически отсутствовала (табл. 1).

Отмечаемое возрастание относительной численности бинуклеарных и собственно многоядерных МФ свидетельствовало о положительной динамике образования этих клеточных форм в условиях БЦЖ-инфицированности. Характер изменения величин показателей частоты встречаемости бинуклеарных и многоядерных МФ в культурах ПК экспериментальных групп определялся степенью напряженности процессов формирования и апоптоза макрофагальных производных.

Это согласуется с фактами, указывающими на роль процессов мультинуклеации в формировании многоядерных МФ, реализующихся посредством амитотического деления ядер и клеточного слияния [4]. В этой связи хотелось бы уточнить, что роль амитотического деления ядер, весьма значимая в процессе мультинуклеации МФ в интактных клеточных культурах, существенно уступает таковой в культурах клеток, выделенных от БЦЖ-инфицированных животных. В последнем случае первостепенное значение в формировании многоядерных МФ играет процесс клеточного слияния.

Из вышеизложенного следует, что бинуклеарные и многоядерные МФ имели большую интенсивность индукции процесса апоптоза по сравнению с одноядерными МФ в культурах ПК на все сроки ведения эксперимента. При этом в культурах ПК экспериментальных групп отмечалось изменение численности МФ, принадлежащих ко всем учитываемым классам ядерности, обладающих признаками экспрессии апоптотических и антиапоптотических факторов, степень резистентности к которым у МФ, вероятно, обусловлена их классом ядерности, детерминирующим структурно-функциональные особенности клеток. При этом снижение численности МФ, разнящихся по классам ядерности, с признаками экспрессии антиапоптотического фактора Bcl-2 и значительное возрастание количества экспрессирующих Bad бинуклеарных и многоядерных МФ регистрируется на 3-месячный срок наблюдения.

В то же время следует отметить, что процесс регуляции апоптоза МФ основан не только на действии белков-регуляторов Bad и Bcl-2, но также других факторов, включая некоторые цитокины. Кроме того, контроль численного состава субпопуляций МФ, разнящихся по классам ядерности, осуществляется как вследствие апоптоза этих клеток, так и в результате реакций мультинуклеации и, прежде всего, процессов клеточного слияния, обусловливающих формирование бинуклеарных и многоядерных МФ.

В частности, TNF-α является цитокином, инициирующим фузию МФ, детерминирующую формирование макрофагальных полинуклеаров, и индуцирующим апоптоз этих клеток. Тогда как IL-4 индуцирует реакции клеточного слияния МФ и ингибирует их апоптоз. При этом, на наш взгляд, стоит особо подчеркнуть, что TNF-α и IL-4 имеют значение именно в регуляции противоположно направленных по своей сущности процессов мультинуклеации и апоптоза МФ, обусловливающих количественный состав их субпопуляций. Немаловажно также, что некоторые другие факторы, в частности GM-CSF, который обладает регуляторной функцией в отношении реакций клеточного слияния, определяющего процессы мультинуклеации МФ, также играют роль в контроле численности субпопуляции многоядерных МФ.

Кроме того, по нашему мнению для исследования проблемы апоптоза многоядерных МФ и проведения цитологического анализа этих клеток небезынтересно, что поскольку наблюдаются различия в структуре и функциях многоядерных клеток различных типов [4], то выделение уточняющих признаков, характеризующих клетки, требуется для адекватного проведения цитологического анализа.

В частности, распределение белков Bad и Bcl-2 в цитоплазме может обладать определенными особенностями. Возможно, существует зависимость локализации этих белков в цитоплазме клеток, которые разнятся по своим структурным и функциональным характеристикам, что может относиться также к МФ нескольких типов, причисляемых также к многоядерным производным этих клеток.

При проведении цитологического анализа культур перитонеальных МФ с применением методов иммуноцитохимического детектирования белков Bad и Bcl-2 в цитоплазме клеток было выделено несколько типов распределения этих белков в эндоплазме МФ, принадлежащих к различным классам ядерности. Регистрировали мононуклеарные и двуядерные МФ с преимущественной локализацией белков Bad и Bcl-2 в нескольких зонах периферической области эндоплазмы.

В клеточных культурах отмечали присутствие двуядерных МФ с локализацией белков Bad и Bcl-2 в одной зоне периферической области эндоплазмы и с локализацией этих белков вокруг ядер. Многоядерные МФ содержали белки Bad и Bcl-2 в межъядерной зоне, как и бинуклеарные МФ. Тогда как у МФ всех учитываемых классов ядерности регистрировали присутствие белков Bad и Bcl-2 также в зоне эндоплазмы, находящейся между центральной и периферической областью таковой.

Возможно, что вышеописанные варианты локализации в цитоплазме МФ белков Bad и Bcl-2 были детерминированы характером реализации внутриклеточных процессов, протекающих в соответствующих зонах эндоплазмы, что необходимо учитывать при проведении иммуноцитохимического анализа клеточных культур, содержащих МФ, разнящиеся по классам ядерности.

Заключение

Таким образом, результаты исследования свидетельствуют о существовании различий в динамике экспрессии проапоптогенных и антиапоптотических белков-регуляторов у МФ, класс ядерности которых обусловливает специфику реализации их апоптоза. При этом характер изменения численного состава субпопуляций многоядерных МФ был детерминирован не только интенсивностью процесса их апоптоза, но и напряженностью реакций мультинуклеации, на что указывала положительная динамика формирования данных макрофагальных производных в условиях БЦЖ-инфицированности. Изучение вышеизложенных аспектов представляется актуальным в плане создания перспективных методов цитологической диагностики и терапевтической коррекции гранулематозных заболеваний.