Scientific journal

International Journal of Applied and fundamental research

ISSN 1996-3955

ИФ РИНЦ = 0,593

Биологически активные молекулы: цитокины и факторы роста – играют ключевую роль в регуляции процессов восстановления тканей после повреждения. Активация и оптимальное использование эндогенных биоактивных молекул является важнейшей задачей регенеративной медицины. Одним из возможных источников факторов роста в организме при патологических процессах может быть фракция тромбоцитов или продукты на их основе.

Cтруктура и функции тромбоцитов подробно изучены и освещены в литературе. Известно, что в α-гранулах тромбоцитов содержится комплекс биологически активных протеинов – факторов роста [1–3]. Среди них для регенерации кожи важнейшее значение имеют тромбоцитарный фактор роста (PDGF), фактор роста эндотелия сосудов (VEGF-А), трансформирующий фактор роста (TGF-β), фактор роста фибробластов (FGF) и некоторые другие [2–5]. В сложном каскаде молекулярных событий, который обеспечивает процесс регенерации тканей после повреждения, участвуют все указанные протеины, а их функции дополняют и на каких-то этапах дублируют друг друга. Каждый из факторов роста характеризуется плейотропным действием, т.е. имеет много мишеней. Эффекты воздействия факторов на разные клетки-мишени могут различаться, что определяется как самой клеткой мишенью, так и наличием и соотношением других факторов роста, их синергическим действием. В α-гранулах тромбоцитов кроме факторов роста содержатся и другие активные молекулы: остеокальцин, остеонектин, фибриноген, фибронектин, витронектин, тромбоспондин-1, цитокины, хемокины, металллопротеазы, фунгицидные белки, факторы коагуляции [6].

Накопление данных о биологически активных веществах, содержащихся в α-гранулах тромбоцитов, послужило основанием для клинического применения продуктов на основе тромбоцитов. Такими продуктами в первую очередь стала обогащенная тромбоцитами плазма [7, 8] и тромбоцитарный лизат – ТЛ [9, 10]. Положительный эффект применения обогащенной тромбоцитами плазмы отмечен при длительно незаживающих ранах, трофических язвах, травматических повреждениях кожного покрова и некоторых других патологиях покровных и мягких тканей [11–13].

Активация процессов регенерации с использованием продуктов на основе тромбоцитов при таких сложных и тяжелых поражениях, каковыми являются ожоги, имела бы существенное значение. Хорошо известно, что течение ожоговой болезни сопровождается угнетением и нарушением функций всех органов и систем организма, в том числе и системы кроветворения. Поэтому нельзя исключить снижение содержания тех или иных факторов роста в тромбоцитах и, как следствие, в сыворотке пациентов с ожоговой травмой, что может влиять на процесс заживления ожоговой раны. Для понимания этого вопроса необходимо исследование изменений основных факторов роста у пациентов с ожоговыми поражениями.

Цель работы: провести сравнительное исследование содержания основных факторов роста (PDGF-ВВ, VEGF-А, FGFb, TGF-β) в ТЛ и сыворотке пациентов с ожоговой болезнью и условно здоровых добровольцев.

Материалы и методы исследования

Материалом для исследования служили сыворотка и ТЛ периферической крови восемнадцати условно здоровых добровольцев и 31 пациента с ожоговой травмой 2–3 степени, находившиеся на лечении в Ожоговом центре Университетской клиники ФГБОУ ВО ПИМУ Минздрава России. Площадь поражения кожи у обследованных пациентов составляла от 10 до 80 % (ср. – 42,8 ± 8,9 %). В зависимости от площади поражения пациенты были разделены на две группы: 1 группа – пациенты с ожогом площадью от 10 до 20 % п.т., 2 группа – пациенты с ожогом более 20 % п.т. Среди пострадавших преобладали люди работоспособного возраста от 21 до 61 года (40,68 ± 6,8), 23 мужчины, 8 женщин. Все пациенты получали комплексное лечение, включавшее инфузионно-трансфузионную, антибактериальную терапию, хирургическое лечение. Протокол исследования был одобрен локальным этическим комитетом ФГОБУ ВО ПИМУ Минздрава России, и каждый пациент дал добровольное информирование согласие на участие в нем.

Кровь для исследования забирали из кубитальной вены: для получения сыворотки – без консерванта, для получения тромбоцитной массы (ТМ) – с цитратом. Сыворотку получали стандартным методом после 15-минутной инкубации при комнатной температуре с последующим центрифугированием при 3000 об/мин в течение 10 минут, отбирали, аликвотировали и замораживали при – 80 °С для последующего исследования.

Для исследования содержания биологически активных протеинов в динамике образцы крови у пострадавших с ожоговой травмой > 20 % п.т. забирали трижды. Первый раз – непосредственно при поступлении в клинику (первые семь дней после травмы), второй – в период разгара заболевания (так называемый «период напряженных компенсаторных процессов» [14] – 10–20 день после инциндента), третий – на этапе полного восстановления кожного покрова перед выпиской из стационара (21 день и более после травмы). Время забора крови для исследования было отделено от времени гемо- и плазмотрансфузий, как минимум на 48 часов. ТМ пациентам не переливалась.

ТМ получали методом двухэтапного центрифугирования и нормировали по концентрации тромбоцитов (1,75×109 тромбоцитов/мл). Для получения ТЛ использовали метод температурного лизиса (три цикла быстрого замораживания при –80 °С на 24 часа с последующим размораживанием при +37 °С) [15]. Такой метод приводит к разрушению α-гранул тромбоцитов и высвобождению из них факторов роста. В этом случае в ТЛ отсутствуют примеси биохимических активаторов, а концентрация факторов FGFb, PDGF- ВВ, TGF-β и VEGF-А достаточно высока. По данным литературы содержание белка в ТЛ при таком способе получения минимально [6], поэтому загрязненность его веществами, способными вызвать неблагоприятные иммунологические реакции, сводится к минимуму.

Далее образцы центрифугировали при 4000 об/мин для осаждения фрагментов клеток, фильтровали через фильтр 0,22 мм и после микроскопического контроля с негативным результатом аликвотировали и замораживали при –80 °С.

Факторы роста (PDGF-BB, VEGF-A, TGF-β, FGFb) в сыворотке и ТЛ определяли методом твердофазного иммуноферментного анализа, используя наборы реагентов «eBioscience», USA (PDGF – BB, VEGF-A, TGF-β1) и набор фирмы R&D systems (USA) для определения FGFb. Величину оптической плотности регистрировали на анализаторе «Sunrise» (Австрия) с использованием программы «Magellan», позволяющей в автоматическом режиме строить калибровочную кривую и определять концентрацию исследуемых веществ.

Статистическую обработку проводили методами непараметрической статистики с применением критериев парных сравнений Вилкоксона, Манна – Уитни с использованием программ STATISTICA 6.0.

Результаты исследования и их обсуждение

Показано, что как у условно здоровых доноров, так и у пациентов с ожоговой травмой на всех этапах исследования, содержание факторов роста в ТЛ и сыворотке было подвержено значительным колебаниям. При сравнении содержания факторов роста в сыворотке и ТЛ у здоровых доноров и пациентов с ожоговой болезнью, независимо от тяжести ожоговой травмы и срока обследования, отмечается, что уровень исследованных протеинов в сыворотке, как правило, меньше, чем в ТЛ. Полученные данные согласуются с результатами исследований других авторов, демонстрирующих преобладание содержания факторов роста в тромбоцитах по сравнению с сывороткой [11]. При этом надо отметить, что статистически значимых отличий между уровнем протеинов в ТЛ у здоровых и пациентов с ожоговой травмой, независимо от площади поражения и стадии ожоговой болезни, не зафиксировано. В то же время отмечается тенденция к снижению уровня протеинов в сыворотке пациентов при поступлении в стационар, а содержание VEGF-A (табл. 1) у пациентов с ожогом > 20 % п.т., по сравнению с уровнем у здоровых, снижено статистически значимо.

У части пострадавших (9 человек) в период разгара ожоговой болезни определяли дополнительно основной фактор роста фибробластов (FGFb). В то время как в сыворотке и ТЛ условно здоровых добровольцев FGFb практически не определялся (ср. 0,91 ± 0,659 пг/мл), у пациентов с ожогами содержание FGFb составило около 40 пг/мл (ср. 39,6 ± 10,7 пг/мл). В ТЛ этой группы пациентов уровень FGFb достоверно превышал таковой у здоровых, 55,03 ± 11,33 пг/мл и 86,77 ± 14,07 пг/мл соответственно. Указанные изменения могут свидетельствовать об интенсификации процессов ангиогенеза и пролиферации в этот период ожоговой болезни, в регуляции которых участвует этот медиатор [16, 17].

К сожалению, как показывает опыт нашей клиники, пациенты с ожоговой травмой до поступления в клинику не получают адекватного лечения на местах. Поэтому у них, как правило, при поступлении преобладают явления воспаления. Период разгара ожоговой болезни характеризуется интенсивной хирургической активностью (перевязки, еженедельные операции некрэктомии и/или свободной кожной пластики). Раневая поверхность при обширных ожоговых поражениях в этот период неоднородна: образовавшаяся грануляционная ткань, донорские раны на разных этапах заживления, участки с выраженными явлениями воспаления, зоны эпителизации, прижившиеся и приживающиеся аутотранспланты. Таким образом, в этот период фиксируются все этапы изменения раневой поверхности: воспаление, пролиферация, начало ремоделирования раны. Соответственно, на этом этапе ожоговой болезни требуется напряженная работа всех механизмов, регулирующих как процессы ангиогенеза, так и пролиферации клеток мезенхимного ряда, экспансии эпителильных клеток, так и ремоделирования внеклеточного матрикса. Результатом является наблюдаемое увеличение содержания всех ростовых факторов (PDGF, VEGF,TGF-β), участвующих в регуляции этих процессов [2–5].

В период реконвалесценции происходит постепенная стабилизация процессов с возвращением содержания факторов роста, как в сыворотке, так и в ТЛ, к исходному уровню. Динамика и протяженность этого процесса, вероятнее всего, обусловлена тяжестью ожоговой травмы.

Заключение

Таким образом, уровень факторов роста (PDGF-ВВ, VEGF-А,TGF-β, FGFb) у пациентов с ожоговой травмой, как и у здоровых, в ТЛ превышает содержание этих протеинов в сыворотке. Содержание протеинов (PDGF-ВВ, VEGF-А,TGF-β) в ТЛ независимо от площади поражения и стадии ожоговой болезни не отличается от такового у здоровых добровольцев, а уровень FGFb в период разгара процесса превышает его.

Содержание факторов роста в сыворотке и ТЛ в процессе течения ожоговой болезни изменяется однонаправленно с максимальной выраженностью в период разгара ожоговой болезни. При восстановлении целостности кожных покровов и улучшении состояния пациентов (период реконвалесценции) отмечается постепенное снижение уровня факторов роста и в сыворотке, и в ТЛ. Отсутствие количественных изменений содержания основных факторов роста в ТЛ у пациентов с ожоговой травмой по сравнению с таковым у здоровых добровольцев свидетельствуют о сохранении синтеза этих протеинов, несмотря на тяжесть патологического процесса. Эти результаты позволяют говорить об отсутствии необходимости системного введения экзогенных факторов роста при терапии ожоговой травмы и о возможности использования аутологичного ТЛ для местного применения.