Scientific journal

International Journal of Applied and fundamental research

ISSN 1996-3955

ИФ РИНЦ = 0,593

Первые упоминания о мозаичной анеуплоидии хромосомы Х (X chromosome mosaic aneuploidy) – ХМА относятся к 1960-м гг. в связи с активным изучением генетических причин синдрома Шерешевского – Тернера и дисгенезии гонад [1, 2]. Позднее феномен ХМА неоднократно упоминается в работах по обследованию групп женщин с нарушением репродуктивной функции (бесплодие, повторные спонтанные аборты, преждевременное нарушение функции яичников и др.) [3, 4]. Наличие ХМА у обследованных женщин расценивалось как негативный генетический фактор, влияющий на репродуктивную функцию [5, 6].

Известно, что одна из хромосом Х в женском организме подвержена инактивации, проходит процесс репликации позже и значительно чаще аутосом отстает при расхождении в анафазе, что приводит к неправильному расхождению хромосом. В результате частой постзиготической анеуплоидизации хромосомы Х в соматических клетках возникает мозаицизм низкого уровня с присутствием клеток, содержащих различное количество хромосом Х. Кроме того, анеуплоидные по хромосоме Х клетки более жизнеспособны по сравнению с клетками, имеющими аутосомную анеуплоидию, включая клетки как с моносомией хромосомы Х, так и полисомные клетки с инактивированными дополнительными хромосомами Х [7]. Учитывая вышеизложенное, следует сказать, что мозаичная анеуплоидия хромосомы Х отражает нарушение расхождения хромосом и связана с нестабильностью генома. Мозаицизм по хромосоме Х низкого уровня зафиксирован также в клетках головного мозга больных с различными психическими заболеваниями, у детей с расстройством аутистического спектра, а также у матерей детей с недифференцированной умственной отсталостью и аутизмом [8, 9]. Мозаичная анеуплоидия Х низкого уровня, вероятно, представляет собой динамический процесс анеуплоидизации и может являться свидетельством нестабильности генома. В данной работе исследована группа из 71 женщины с наличием ХМА, превышающем возрастные значения, с целью последовательного цитогенетического и FISH исследований при их отягощенном репродуктивном и генетическом анамнезе.

Материалы и методы исследования

В работе проведены цитогенетические и молекулярно-цитогенетические (fluorescence in situ hybridization – FISH) исследования 71 женщины с отягощенным репродуктивным и генетическим анамнезом. Причины обследования были следующие: бесплодие, спонтанные аборты, мертворождение, наличие детей с задержкой психоречевого развития (ЗПРР), умственной отсталостью, расстройством аутистического спектра (РАС), врожденными пороками (ВПР) и/или микроаномалиями развития (МАР), имеющих в том числе хромосомные перестройки или другую генетическую патологию. Анализировалась группа женщин с мозаичной анеуплоидией хромосомы Х, превышающей допустимый возрастной уровень.

Цитогенетический анализ проводился на хромосомах лимфоцитов периферической крови, культивированных 72 часа. У каждого пациента анализировали 20–30 метафазных пластинок [10]. Для уточнения мозаицизма, выявленного цитогенетическим методом, было проведено молекулярно-цитогенетическое исследование методом FISH на интерфазных ядрах с центромерным ДНК зондом на хромосому Х (DXZ1) в сочетании с контрольным ДНК зондом на прицентромерный участок хромосомы 1 (1q12), использованным для определения контроля плоидности хромосомного набора в ядрах и оценки микроядер с хромосомой X (ХМЯ). Тетраплоидные ядра, встречающиеся при культивировании лимфоцитов, в исследовании не учитывались. У каждой женщины было проанализированно не менее 1000 интерфазных ядер лимфоцитов [11, 12]. При оценке доли анеуплоидных клеток в качестве сравнения использовались ранее опубликованные исследования здоровых женщин, в которых указаны референтные значения ХМА для разных возрастных групп [13, 14].

Результаты исследования и их обсуждение

Информация об отягощенном репродуктивном и генетическом анамнезе, результатах цитогенетических и FISH исследованиях группы женщин представлена в таблице.

Все обследованные женщины были фенотипически нормальными. Средний возраст женщин составлял 34,2 (от 23 до 47 лет). В зависимости от анамнеза обследованных женщин можно было условно разделить на две группы: I – женщины с бесплодием (n = 42) и II – женщины, имеющие детей с наследственными нарушениями (n = 29). В общей группе у 45,1 % женщин были отмечены случаи одного или нескольких спонтанных абортов. В группе с отягощенным репродуктивным анамнезом у 10 женщин (23,8 %) были случаи внематочной беременности, также у 10 женщин (23,8 %) – безрезультатные попытки ЭКО (до 5-ти попыток), преждевременное нарушение функции яичников наблюдалось у 4 женщин. Во второй группе 16 женщин имели детей с ЗПРР, умственной отсталостью, аутизмом, ВПР и/или МАР, причем 6 женщин из них имели двоих и более больных детей. Из этих больных детей (n = 23) было 18 мальчиков на 5 девочек. Среди детей с хромосомными аномалиями наблюдался синдром Дауна у 3 детей, синдром Шерешевского – Тернера – у 2 детей, крупные несбалансированные структурные перестройки хромосом – у 6 детей. Моногенные синдромы были выявлены у 2 детей. В одном случае структурная аномалия хромосомы Х сочеталась с моногенным синдромом (№ 71 в таблице).

При цитогенетическом исследовании, помимо клеток с анеуплоидией по хромосоме Х, у 28,6 % женщин была обнаружена хромосомная нестабильность в виде неспецифичных трисомий аутосом, фрагильности и структурных хромосомных перестроек, в том числе хромосомы Х. Проведенное FISH исследование выявило мозаичную анеуплоидию хромосомы Х со следующей средней частотой: ядра с одним сигналом на хромосому Х наблюдались в 5,3 % (1,5–17,1 %) клеток, с тремя сигналами – в 2,0 % (0,2–5,8 %), с четырьмя сигналами – в 0,3 % (0–1,2 %). В некоторых случаях наблюдались пять и более (до 9) Х сигналов в ядрах (рис. 1).

Во всех случаях преобладающим аномальным клоном являлась моносомия хромосомы Х (45,Х), которому всегда сопутствовал следующий по частоте клон с трисомией (47,ХХХ). Интерфазные ядра с четырьмя хромосомами Х встречались с малой частотой у большинства (74,6 %) пациенток. Помимо повышенного уровня анеуплоидии хромосомы Х у 41 женщины (57,7 %) в общей группе были обнаружены микроядра c материалом хромосомы Х. Средняя частота встречаемости ХМЯ на 1000 интерфазных ядер составляла 0,93 % (от 0,4 до 2,1 %). Количество центромерных сигналов Х в таких микроядрах варьировало от 1 до 8, при отсутствии контрольных сигналов на хромосому 1 (рис. 2). Наиболее часто встречались микроядра с двумя Х сигналами. Микроядра c хромосомами Х описаны в литературе, встречаются у женщин в возрасте от 60 лет и состоят из хромосом, отстающих при расхождении в анафазе [15]. Средний возраст женщин, у которых были обнаружены ХМЯ в настоящем исследовании, составлял 35,9 лет.

Известно, что процесс анеуплоидизации хромосомы Х происходит в организме каждой женщины, и доля анеуплоидных клеток увеличивается с возрастом. Devi с соавторами, например, вычислили, что у женщин без нарушения репродуктивной функции образуется около 700 лимфоцитов с кариотипом 45,Х на 106 клеток ежегодно [16]. В результате процесса нерасхождения образуются также клетки с полисомией хромосомы Х, но не в таком количестве, как с моносомией, что показывают FISH исследования, за счет того, что добавочные хромосомы Х в результате отставания в анафазе элиминируются из ядра, вероятно, в виде микроядер [17–19]. Однако, по-видимому, у некоторых женщин процесс анеуплоидизации хромосомы Х в организме происходит более интенсивно.

Представленные нами результаты FISH исследования группы женщин с ХМА выше возрастного уровня показали, что во всех случаях помимо клеточной линии 45,Х присутствуют клеточные линии с полисомией хромосомы Х. Кроме того, наши данные показывают, что почти у 60 % женщин присутствовали микроядра, состоящие из материала хромосом Х. Микроядра с материалом хромосомы Х хорошо охарактеризованы, встречаются у женщин с возрастом после 60 лет и ассоциируются с процессами старения, клеточным апоптозом и хромосомной нестабильностью [20], впрочем, как и микроядра, состоящие из аутосом или их фрагментов. Повышение уровня мозаичной анеуплоидии хромосомы Х также связано с процессом старения организма.

Исходя из полученных результатов данного исследования, основанных на присутствии клеточных линий с полисомией хромосомы Х в сочетании с ХМЯ, мы предполагаем, что феномен мозаичной анеуплоидии хромосомы Х низкого уровня является динамическим процессом анеуплоидизации хромосомы Х, отражающим нестабильность генома. Это подтверждается отягощенным репродуктивным и генетическим анамнезом женщин. Спонтанные аборты, наблюдавшиеся у 45,1 % женщин (которые, как известно, в 60 % этиологически связаны с хромосомными аномалиями), могут иметь связь с нестабильностью генома. Случаи неудачных попыток ЭКО и случаи внематочных беременностей этиологически также могут быть связаны с геномной нестабильностью. ХМЯ встречались не во всех случаях мозаицизма, но общая тенденция была такова, что их встречаемость коррелировала с высоким уровнем полисомных клеток, содержащих 3 и более хромосом Х. Можно предположить, что наличие ХМЯ связано с повышенной интенсивностью процесса анеуплоидизации. Нельзя исключить, что в некоторых случаях с бесплодием при ХМА была представлена констуционным мозаицизмом с большим преобладанием клона 45,Х над клоном 47,ХХХ (по результатам FISH исследования), как, например, в случае 25 таблицы.

Предположение о том, что ХМА низкого уровня может быть свидетельством геномной нестабильности, неоднократно высказывалось в научных публикациях [21, 22]. Последние исследования показывают, что при некоторых психических заболеваниях наблюдается геномная нестабильность в клетках центральной нервной системы, характеризующаяся хромосомным мозаицизмом и множественными аномалиями генома. Так, повышенная мозаичная анеуплоидия зафиксирована в клетках мозга при таких заболеваниях, как болезнь Альцгеймера, синдром Луи – Барр и шизофрения [23, 24]. Обследования детей с аутизмом выявляют относительно высокий уровень ХМА по сравнению с контрольными образцами, как в лимфоцитах крови, так и в нейронах головного мозга [9, 25]. Вероятно, часть женщин с ХМА является носителями определенных мутаций, которые, в свою очередь, могут оказывать влияние на расхождение хромосом Х в соматических клетках. В частности, установлено, что у женщин с премутацией в гене FMR1, связанной с синдромом FRAXA, наблюдается преждевременное нарушение функции яичников и может отмечаться мозаичная анеуплоидия хромосомы Х [26]. Существует мнение, что наличие ХМА низкого уровня может отражать процесс преждевременного старения [21, 27].

Таким образом, на основании результатов настоящего исследования и данных литературы можно подтвердить вывод о том, что мозаичная анеуплоидия хромосомы Х низкого уровня является свидетельством нестабильности генома.

Заключение

Проблема геномной нестабильности в последнее время приобретает большую актуальность, поскольку связана с онкологическими, психическими заболеваниями, увеличением частоты рождения детей с пороками и задержкой развития, с бесплодием. Современные генетические методы диагностики все чаще выявляют случаи множественного повреждения генома у детей с ЗПРР, РАС и ВПР, случаи сочетания двух и более генетических синдромов у одного ребенка. Участились случаи рождения в одной семье нескольких больных детей с различной генетической патологией. Возможно это связано с нестабильностью генома у родителей, выявить которую весьма сложно. Наиболее распространенный цитогенетический метод для определения хромосомной нестабильности (определение нестабильности генома) постепенно заменяется методами молекулярными, позволяющими обнаружить мутации в генах-регуляторах клеточного цикла и генах, участвующих в процессе репарации ДНК. Однако надо отметить, что методы определения нестабильности на клеточном уровне не утратили своей актуальности. Когда на обследование поступает больной ребенок с генетической патологией, мы оказываемся перед свершившимся фактом его заболевания, причины которого, возможно, следует искать, исследуя геном родителей и, в частности, его нестабильность. Проведение таких исследований необходимо также женщинам, подвергающимся безрезультатным попыткам ЭКО и имеющим в анамнезе случаи внематочной беременности, что, как правило, не делается в центрах репродукции. Назначение FISH исследования для определения степени ХМА было бы целесообразно для женщин с проблемами репродукции и имеющими больных детей с целью прогноза будущего потомства, выбора метода проведения пренатальной диагностики при последующей беременности, а также для разработки таргетной терапии, направленной на стабилизацию генома. Несомненно, женщины с ХМА требуют более детального обследования современными молекулярными методами для выявления возможных причин геномной нестабильности.