Scientific journal

International Journal of Applied and fundamental research

ISSN 1996-3955

ИФ РИНЦ = 0,593

Современная генетика кур тесно связана с изучением полиморфизма генов, влияющих на рост и развитие птицы. Это обусловлено тем, что мясо кур является важной составляющей рациона человека, поскольку служит источником белка, аминокислот, витаминов и микроэлементов.

В последние годы внимание исследователей обращено к поиску взаимосвязей между полиморфными вариантами различных генов, ответственных за рост и развитие, и показателями продуктивности птицы.

Ген миостатина, благодаря выработке соответствующего белка, влияет на развитие мускулатуры у высших позвоночных негативным образом [1]. Если по каким-то причинам происходит блокировка пути от гена MSTN к мышцам, наблюдается усиленный рост последних. Мутации, приводящие к изменениям последовательности ДНК в различных участках гена MSTN встречаются у ряда животных. У высших позвоночных MSTN тканеспецифичен, его синтез происходит в скелетных мышцах, на которые он и оказывает биологические эффекты [2, 3].

Нуклеотидная последовательность гена миостатина полностью прочитана, а также известно, что этот ген включает в себя три экзона и два интрона [4]. Сейчас особое внимание уделяется обнаружению однонуклеотидных замен (SNP) в смысловых участках миостатинового гена, для того, чтобы выявить их ассоциации с признаками продуктивности [5, 6].

Целью нашей работы было определение влияния типа кормления на скорость роста курочек пушкинской породы в зависимости от генотипа по замене rs313744840 в гене миостатина.

Материалы и методы исследования

Материалом для исследования послужила ДНК, выделенная из крови кур пушкинской породы. Кровь брали с помощью инъекции одноразовым шприцем из подкрыльцовой вены крыла у цыплят в возрасте 3–4 недель и помещали в пробирки объемом 0,5–1,5 мл, содержащие антикоагулянт ЭДТА, который препятствует свертыванию крови, а также обладает консервирующими свойствами. До выделения ДНК образцы хранили в холодильнике при отрицательных температурах, чтобы замораживание жидкой фракции крови привело к разрушению клеточных оболочек. ДНК выделяли по методике с применением для расщепления белков фермента протеиназы К (Сибэнзим, Россия) и дальнейшей очистки с помощью фенола.

При рождении каждый цыпленок помечался специальной крылометкой с индивидуальным номером, который закреплялся за ним на весь период наблюдений. Было сформировано две группы курочек. Одна (n = 40) выращивалась на кормах для бройлеров (корм ПК-5, производство Тосненского комбикормового завода) до возраста 63 дня. Другая группа (n = 64) – на кормах для молодняка кур-несушек (ПК-4, производство ТККЗ). Оба комбикорма относятся к полнорационным кормам. Корм ПК-5 характеризуется повышенным содержанием протеина (до 20 %) и обменной энергии (до 310 ккал в 100 г корма).

Определение живой массы кур проводили путем взвешивания на весах марки «Госметр» в различные периоды жизни: при рождении, в 7, 14, 21, 34, 40, 49, 56, 63 дня. Курочки, выращенные на кормах с повышенным содержанием протеина и обменной энергии, также были взвешены в возрасте 70 дней. А курочки, выращенные на кормах для молодняка кур-несушек, в возрасте 90 дней.

Для определения генотипов использовали полимеразную цепную реакцию (ПЦР) с использованием следующих праймеров: прямой 5’-AAC-CAA-TCG-TCG-GTT-TTG-AC-3’ и обратный 5’-CGT-TCT-CTG-TGG-GCT-GAC-TA-3’) [5]. С их помощью получали один участок экзона 1 миостатинового гена (AF346599). Продукты амплификации обрабатывали ферментом рестрикции HpaII, разрезающим ДНК в определенной точке. Это замена G/A в положении rs313744840 миостатинового гена.

ПЦР проводили на амплификаторе «BioRad» (США) с использованием реакционной смеси следующего состава: 67 мМ трис-HCl pH 8,6, 2,5 мM MgCl2, 16,6 мM NH4OH, 0,125 мМ каждого из дезоксирибонуклеозидтрифосфатов (dATP, dGTP, dCTP, dTTP), 0,5 мкМ прямого и обратного праймеров, 50–100 нг геномной ДНК и 2,5 ед Taq-полимеразы («Сибэнзим», Новосибирск). Общий объем реакционной смеси составлял 10 мкл. Применяли режим, состоящий из 35 циклов: 30 сек – 94 °С, 30 сек – 60 °С, 30 сек – 72 °С.

Фрагменты ДНК разделяли электрофорезом в течение 1 часа при рабочем напряжении 7,5 В/см в ТВЕ буфере (45 мМ трис-борат, 1 мМ ЭДТА). Процесс проводили с использованием 1,5 % агарозного геля, содержащего флуоресцентный краситель бромистый этидий. Смесь после рестрикции вносили в кармашки геля. В качестве маркера, позволяющего оценить длину фрагментов ДНК на геле, использовали pUC19/MspI (Thermo Fisher Scientific). Сигнал фотографировали в системе гель-документации фирмы Кодак.

Статистическую обработку полученных результатов проводили с помощью пакета программ SigmaPlot.

Результаты исследования и их обсуждение

В результате определения генотипов по замене rs313744840 в гене миостатина и расчета взаимосвязи между генотипами и живой массой птицы в разные периоды жизни были обнаружены следующие закономерности.

Оказалось, что курочки с генотипом АА по замене rs313744840 в гене MSTN, выращиваемые на кормах для бройлеров, начали достоверно (p < 0,05) отличаться от своих сверстниц с генотипом AG с возраста 28 дней (табл. 1). Это преимущество в росте сохранялось до конца периода кормления кормом с повышенным содержанием протеина и обменной энергии.

Если сравнить курочек с генотипом АА по замене rs313744840 в гене миостатина, выращенных на разном корме, то можно отметить, что достоверно большую живую массу они имели лишь в возрасте 34 дня и 40 дней. В остальные периоды наблюдений достоверных различий не отмечено, хотя средние показатели живой массы у курочек, выращенных на бройлерных кормах были выше (табл. 3).

Кормление является важной составляющей в организации содержания и выращивания молодняка кур. В первые месяцы жизни цыплята не только интенсивно растут, но и происходит формирование всех систем их организма. Для того, чтобы генетический потенциал особи раскрывался полностью, кормление на стадии выращивания должно быть полноценным.

Пушкинская порода кур относится к породам мясо-яичного типа. От нее возможно получать достаточное количество мяса без потери яйценоскости, что делает представителей этой породы привлекательным объектом для птицеводов-любителей [7].

Объем мышечной массы у высших позвоночных связан с работой гена миостатина (MSTN). Миостатин – белок, подавляющий рост и дифференцировку мышечной ткани в организме. Он выступает в качестве негативного регулятора массы скелетных мышц и действует по принципу обратной связи. При возрастании мышечной массы увеличивается секреция миостатина, что тормозит дальнейший рост мышц [1].

Природные мутации, которые снижают количество миостатина и/или подавляют его функции, были выявлены у человека, ряда сельскохозяйственных животных и птиц. Было найдено большое количество SNP в этом гене, влияющих на скорость роста, репродуктивные показатели и качество мяса [4, 8]. В различных породах овец, свиней, собак и кур определены мутации в некодирующих регуляторных областях, что влияет на уровень экспрессии MSTN, а следовательно, на рост и объём мышечной массы [9]. Изучалось влияние SNP в этом гене на живую массу в различных условиях выращивания и смертность цыплят [5].

Ранее нами уже были выявлены взаимосвязи между живой массой кур и заменой rs313744840 в гене миостатина [6, 8]. Животные, несущие аллель А по этой замене, обладали повышенной скоростью роста.

В проведенном исследовании курочки, выращенные на кормах для бройлеров, с генотипом АА превосходили по живой массе курочек с гетерозиготным генотипом AG (табл. 1). Можно предположить, что у гомозигот АА по изучаемой замене есть значительный потенциал для роста, который не всегда может быть реализован в полной мере на кормах для молодняка кур-несушек (табл. 2). В то же время гомозиготы АА, выращенные на разном корме, отличались друг от друга незначительно.

Заключение

Курочки с генотипом АА, выращиваемые на бройлерных кормах, начали достоверно (p < 0,05) отличаться от своих сверстниц с генотипом AG с возраста 28 дней. Это преимущество в росте сохранялось до конца периода кормления кормом с повышенным содержанием протеина и обменной энергии. Для курочек, выращенных на кормах для молодняка кур-несушек, тенденция к преимуществу по живой массе у гомозигот АА наблюдалась до 40-дневного возраста, но отмеченные различия не были достоверными. К возрасту 90 дней эта группа незначительно обогнала гетерозигот AG по живой массе, а от гомозигот GG практически не отличалась. Курочки с генотипом АА, выращенные на корме с повышенным содержанием протеина и обменной энергии, имели достоверно большую живую массу лишь в возрасте 34 дня и 40 дней. Использование корма с повышенным содержанием протеина и обменной энергии позволяет реализовать генетический потенциал птицы.

Данное исследование выполнено при финансовой поддержке ФАНО России в рамках ГЗ АААА-А18-118021590138-1 с использованием популяций кур из биоресурсной коллекции ЦКП «Генетическая коллекция редких и исчезающих пород кур» (ВНИИГРЖ, Санкт-Петербург – Пушкин).