Достоверно известно, что большинство участников олимпийских команд по биатлону и лыжам из стран Скандинавии являются астматиками. В условиях внешней нагрузки дыхательная поперечнополосатая мускулатура начинает работать у них интенсивнее для компенсации гипоксии, которая возникает вследствие обструкции дыхательных путей [1, 2].
В работах А.Ю. Теплова и соавторов [3–5] было показано, что в условиях развивающейся аллергии (в частности – при белковой сенсибилизации (БС)) сократительные свойства скелетных мышц (СМ) существенно изменяются. Для различных мышц («быстрых» и «медленных») наблюдается разносторонняя направленность, определяемая их природой. Обнаруженная динамика носит адаптационный характер.
Установлено, что одним из механизмов, обеспечивающих проявление адаптации, является изменение возбудимости рецепторов к ацетилхолину (Ах) постсинаптической мембраны [6]. А именно – влияние АТФ как одного из кофакторов синаптической передачи посредством механизмов десенситизации последних, то есть изменения их чувствительности к агонисту – Ах.
Анализ полученных результатов свидетельствует, что обнаруженный механизм адаптации поперечнополосатых мышц к условиям аллергии не является единственным. Очевидно, что изменения способны затрагивать различные участки мышцы, и мы можем предполагать динамику внутриклеточных механизмах электромеханического сопряжения (ЭМС).
Для подтверждения представленной гипотезы нами были проведены серии экспериментов на различных мышцах сенсибилизированных и контрольных мышей in vitro с их сокращением на карбахолин (Кх) и KCl [3]. Сравнение сил этих сокращений позволяет отделять синаптические процессы от механизмов ЭМС, обеспечивающих работу акто-миозиновых комплексов. Анализ результатов подтвердил справедливость высказанного ранее предположения – механизмы адаптации при аллергии работают в тканях как дыхательной, так и двигательных мышц и их динамика носит неоднозначный характер.
Системы про- и антиоксидантного равновесия являются одним из способов поддержания постоянства гомеостаза в организме. Мы предположили, что определенные элементы вышеперечисленных систем должны участвовать в реализации обнаруженных изменений. В настоящей работе представлены данные по изучению содержания конечного продукта работы этих систем – малонового диальдегида (МДА) как в плазме крови, так и тканях дыхательной и двигательной мышц сенсибилизированных и контрольных мышей.
Цель исследования: изучить способность БС определять динамику:
1) силы сокращения на Кх у «смешанной» – m. diaphragma и «быстрой» – m. EDL мышц мыши;
2) количества МДА в тканях этих мышц;
3) количества МДА в сыворотке крови.
Материалы и методы исследования
Мыши массой тела 17–22 г подвергались сенсибилизации овальбумином (ОА) [7], в эксперимент животные забирались на пике сенсибилизации. Содержание малонового диальдегида (МДА) определяли в гомогенатах мышц и сыворотки крови.
Малоновый диальдегид (МДА) исследовался в сыворотке крови и в мышцах контрольных и несенсибилизированных мышей. В сыворотке крови МДА изучался по Т.И. Рахмановой и др. 2009 [8]. Определение МДА в мышцах осуществлялось реакцией с тиабарбитуровой кислотой (ТБК) в высокотемпературной и кислой среде. Ткань мышцы тщательно растиралась в фарфоровой ступке, будучи замороженной жидким азотом. Полученный порошок обрабатывался буферным раствором (pH 7,4) и трихлоруксусной кислотой (ТХУ), после чего центрифугировался 15 мин при 5000 об/мин в ОПН-8 («Лабтех», Россия). Супернатант после смешивания с ТБК на 10 минут помещался в кипящую водяную баню. После охлаждения определялась оптическая плотность (на приборе СФ 103 при длине волны 532 нм против контроля на реактивы) [8].
Изучение сократительных свойств поперечнополосатой мышцы проводилось in vitro в условиях изометрии с помощью датчика силы. Карбахолин (Кх) – добавлялся в ванночку с мышцей в субмаксимальных концентрациях: для m. EDL – 7х10-4М, для m. diaphragma – 2х10-4М. Анализ сократительной функции изолированных мышц проводился по силе сокращения, которая соотносилась с массой мышечного препарата. Животное усыплялось введением летальной дозы этаминала натрия. Полученные данные обрабатывались статистически с использованием t-критерия Стьюдента.
Результаты исследования и их обсуждение
Изучение сократительных свойств показало, что у «смешанной» (m. diaphragma) несенсибилизированной мыши Кх в субмаксимальной концентрации вызывал сокращение мышцы силой 342,8 ± ± 18,54 мг (Рос* – 49,20 ± 1,75 мг/мм3). Сенсибилизация увеличивала силу сокращения до 448,29 ± 19,16 мг (Рос* – 58,66 ± ± 3,97 мг/мм3 (p < 0,01)).
«Быстрая» мышца (m. EDL) показала следующую динамику: Кх в субмаксимальной концентрации вызывал сокращение мышцы несенсибилизированного животного с силой 76,6 + 6,1 мг (Рос* – 9,94 ± ± 0,39 мг/мм3). При сенсибилизации сила ее сокращения уменьшалась до 61,92 ± ± 12,42 мг (Рос* 5,65 ± 0,82 мг/мм3 (p < 0,01)).
Биохимические исследования. Уровень содержания в сыворотке конечного молекулярного продукта перекисного окисления липидов (ПОЛ) – МДА при сенсибилизации уменьшился с 2,65 ± 0,88 до 1,65 ± 0,4 мкМ/л (n = 8, p < 0,05); в тканях мышц изменение этого показателя было разнонаправленным: в m. diaphragma он уменьшился с 246,30 ± 5,28 мкМ/кг до 33, 83 ± 4,68 мкМ/кг (p < 0,001), в m. EDL МДА статистически не изменился, незначительно увеличившись с 111,02 ± 25,61 мкМ/кг до 127,99 ± 8,93 мкМ/кг.
Показано, что содержание МДА в условиях БС изменяется как в сыворотке крови, так и в тканях мышц. Подтверждением отсутствия воспалительного процесса является снижение МДА в сыворотке, который обычно повышает этот показатель [9–11], что может наблюдаться и при развитии аллергии. МДА – ключевой маркер перекисного окисления липидов при оксидативном стрессе, характеризующий в том числе и состояние внутренней среды МВ. Этот факт позволяет использовать динамику уровня свободных радикалов для демонстрации степени их повреждения.
От баланса про- и антиоксидантной систем зависит структура клеточных мембран и жизнеспособность клеток. Исходя из вышесказанного, ПОЛ является одним из факторов, обеспечивающих постоянство гомеостаза и работу механизмов ЭМС в МВ [10]. Экспериментальная модель БС позволила изучить содержание МДА на таком классическом объекте иммунологических и аллергических исследований, каким является мышь [11].
Различия в динамике содержания диальдегида у двух мышц в ходе развития процесса сенсибилизации животного к белку, обнаруженные в нашей работе, подтверждают наличие адаптационных изменений, происходящих в этих тканях в изучаемых условиях. Снижение МДА у m. diaphragma и неизменность этого показателя у m. EDL определяются различиями в возможностях реализации сократительной функции за счет их способности к адаптации.
Показано, что в условиях развивающейся аллергической реакции у обеих мышц характеристики сокращения на холиномиметик изменяются. Динамика силы сокращения у двух мышц носит разнонаправленный характер. У m. EDL она снижается, у m. diaphragma – возрастает. БС гипотетически может затрагивать в СМ различные механизмы ЭМС, включая как постсинаптическую мембрану, так и работу сократительных белков. Результаты экспериментов свидетельствуют, что адаптация осуществляется за счет участия в ее механизмах различных этапов сократительного процесса. Изменение силы, которое характеризуется процессами возбуждения мышечных клеток, носит для «быстрой» и «смешанной» мышц неоднозначный характер. При сокращении на КХ сила мышцы находится в прямой зависимости от чувствительности к холиномиметику. Очевидно, что причины обнаруженных нами изменений обеих мышц кроются как в исходных различиях площади синаптических образований [12], так и в динамике механизмов ЭМС в процессе аллергической перестройки.
Как говорилось выше, в ходе развития белковой сенсибилизации изменениям подвергается как поверхностная мембрана мышечных клеток [13], так и остальные этапы ЭМС [3, 14]. Направление динамики силы сокращения «смешанной» мышцы с одной стороны и «быстрой» с другой свидетельствует о принципиальных различиях в механизмах адаптации этих СМ в вышеназванных условиях [6]. Возрастание силы сокращения на Кх у «смешанной» мышцы и снижение этого показателя у «быстрой» подтверждает, что различия в изменениях при БС затрагивают, в первую очередь, процессы возбуждения в синаптическом образовании и носят для различных мышц неоднозначный характер. Разнонаправленное влияние развития аллергии на силу сокращения изучаемых мышц отражает принципиальные различия их организации, что является следствием развития адаптивных механизмов в случае возможных моторных нарушений в ходе формирования аллергической реакции. Вклад в этот процесс различных МВ неоднозначен. В качестве причины мы можем предположить как исходные различия в волоконном составе обеих мышц [12.], так и в вариантах его динамики в процессе БС. Литературные источники свидетельствуют, что m. EDL мыши на 97–100 % состоит из «быстрых» мышечных волокон [12]. «Смешанная» m. diaphragma мыши содержит лишь 88,6 % быстрого миозина. Результаты экспериментов указывают на различия в чувствительности МВ к Кх и являются следствием исходной структуры исследуемых объектов [12] и механизмами его изменения в процессе аллергизации. В качестве маркера окислительного стресса МДА характеризует состояние ряда белков, располагающихся как на мембране, так и в митохондриях и, по всей видимости, является причиной изменений механизмов ЭМС в двигательных и дыхательных мышцах при аллергической перестройке организма.
Для объяснения полученных результатов нами проведен литературный поиск, который показал, что у мышей в ходе развития БС в ткани сердца наблюдается изменение уровня МДА, что, в свою очередь, коррелирует с изменением АТФ-синтазы [15].
Ранее нами было показано, что у «смешанной» (m. diaphragma) мышцы мыши в адаптационных механизмах при БС участвует АТФ [6]. Очевидно, что в этих условиях изменение чувствительности Р2 рецепторов пресинаптической мембраны мионеврального соединения обеспечивает адекватное изменение неквантовой секреции ацетилхолина (Ах), которая вызывает изменение чувствительности постсинаптической мембраны к холиномиметику. В качестве объяснения этих лабораторных эффектов мы можем предположить несколько механизмов. Во-первых, рост концентрации аденозинтрифосфата в тканях, в том числе и самой мышцы вызывает десенситизацию пуриновых (предположительно Р2У) рецепторов пресинаптической мембраны, что снижает их чувствительность к экзогенной АТФ, поступающих в ванночку с препаратом мышцы в ходе эксперимента. У «смешанной» мышцы динамика силы сокращения на холиномиметик при внесении в среду экзогенного аденозинтрифосфата в условиях БС отличается от таковой в контроле. Вторым из возможных объяснений служит следующее. В экспериментальных моделях, используемых в приведенных исследованиях на интактном животном экзогенная АТФ при внесении ее в ванночку с препаратом мышцы устраняет неквантовый выход Ах почти полностью. Для большей наглядности максимальное проявление эффекта АТФ достигается подбором концентрации и временем экспозиции вещества, в ходе чего возможности по осуществлению данного механизма почти полностью истощаются. В условиях БС эндогенная АТФ, которая уже присутствует в ткани мышцы, в результате развития аллергической реакции частично нивелирует возможности снижения неквантовой секреции Ах, после чего экзогенная АТФ, которая вносится в ванночку в ходе эксперимента, не обеспечивает ожидаемого результата.
Таким образом, устойчивость к длительным внешним нагрузкам, а также и при экспериментальной аллергии у «смешанной» мышцы определяется возможностями регуляции их чувствительности к Ах, которые зависят от пуринергических (АТФ-зависимых) механизмов. Работоспособность при этом в условиях целостного организма при продолжительной физической деятельности существенно возрастает. Мы можем предположить, что похожие механизмы обеспечивают снижение утомляемости дыхательных мышц в условиях гипоксии, которая возникает при функциональной недостаточной системы внешнего дыхания обструктивного типа.
Показанная ранее роль аденозинтрифосфата (АТФ) в изменчивости сократительной функции различных СМ в условиях БС [5, 6] позволяет предположить его участие в нескольких механизмах, которые взаимно дополняют друг друга. Роль пуринов в механизмах пластичности мышц при аллергии [6] демонстрируется динамикой интенсивности секреции АТФ, которая выполняет роль кофактора синаптической передачи и определяется нами как одна из причин изменения силы сокращения изолированной мышцы на холиномиметик.
Одновременно показана роль АТФ в качестве участника развития механизмов иммунного ответа [16]. Роль АТФ в качестве регулятора неквантовой секреции ацетилхолина и его участие в генерации аллергической реакции позволяет предполагать изменение концентрации внеклеточного аденозинтрифосфата как одной из причин, определяющих функциональное состояние и дыхательной, и двигательной мышц при БС вследствие изменения возбудимости мембраны МВ. С другой стороны, способность аллергизации по-разному влиять на механизмы гомеостаза у различных мышц подтверждается корреляцией изменения силы сократительного ответа с динамикой уровня МДА. У дыхательной мышцы одновременное увеличение силы сокращения и снижение МДА является следствием как увеличения чувствительности постсинаптической мембраны к ацетилхолину, так и изменениями в иных этапах электромеханического сопряжения. Содержание МДА в ткани «смешанной» мышцы в условиях аллергизации опосредовано являться причиной морфофункциональных сдвигов на мембране и в цитоплазме МВ. Адаптационные механизмы в «быстрой» мышце не связывается с уровнем МДА и снижении силы ее сокращения обеспечиваются иными путями.
Как уже говорилось, предполагаемое нами нарушение баланса систем про- и антиоксидантного равновесия в условиях БС является одной из причин обнаруженной ранее способности механизмов, определяемых влиянием аденозинтрифосфата регулировать сокращение поперечнополосатых мышц, воздействуя на их систему вторичных мессенджеров [17]. Взаимодействие этих систем является одним из способов поддержания постоянства гомеостаза в органах и тканях. Определенные элементы вышеперечисленных систем должны участвовать в реализации обнаруженных изменений. Дополнительным доказательством справедливости этого предположения является корреляция уровня МДА с активностью АТФ-синтазы, показанной на сердце мыши [15].
Необходимо оговориться, что сердечная мышца отличается от скелетной и по выполняемым функциям, и по морфологическим характеристикам. Однако это все же поперечнополосатая мышца, и наши дальнейшие исследования, запланированные в этой области – определение динамики АТФ-синтазы различных поперечнополосатых – скелетных и дыхательных мышц сенсибилизированных и интактных мышей как биохимическими, так и физиологическими методами.
Заключение
Таким образом, и дыхательные, и двигательные мышцы в условиях сенсибилизации демонстрируют пластичность функциональных свойств, которая определяется динамикой различных элементов механизма ЭМС. Будучи локализованными и на постсинаптической мембране, и в цитоплазме миоцитов эти механизмы обеспечивают изменение чувствительности мембраны к холиномиметику, что у «быстрых» и «смешанных» мышц является причиной разнонаправленной динамики силы их сокращения на агонист. Нами показана зависимость изменения сократительных свойств различных СМ в условиях сенсибилизации от состояния систем про- и антиоксидантного равновесия, ее корреляции с изменением одного из ключевых маркеров ПОЛ, каким является МДА. Сопоставление динамики силы сокращения и уровня МДА подтверждает способность БС по-разному менять внутриклеточный гомеостаз у различных СМ. В m. diaphragma возрастание силы сокращения совпадает со снижением МДА. Это отражает работу механизмов компенсации, определяющее как возрастание восприимчивости мышечной мембраны к холиномиметику, так и динамику последующих этапов ЭМС. Изменение содержания альдегида в условиях сенсибилизации у «смешанной» мышцы опосредовано является причиной всех перечисленных изменений в МВ. Одним из основных, на наш взгляд, являются АТФ-зависимые механизмы, которые влияя на вторичные мессенджеры способны регулировать силу сокращения поперечнополосатых мышц [5, 6, 13], что напрямую соотносится с изменениями в балансе систем про- и антиоксидантного равновесия. Данное предположение подтверждается сходством динамики малонового диальдегида с активностью такого фермента как АТФ-синтаза, которая была показана Yarian CS et all. [15] в сердечной мышце мыши. МДА как маркер окислительного стресса, определяет состояние некоторых мембранных и митохондриальных белков, что является причиной последующих изменений в динамики механизмов ЭМС в поперечнополосатых мышцах в ходе развития аллергической реакции. «Быстрая» m. EDL более устойчива к оксидативному стрессу. Данный эффект достигается работой механизмов компенсации и проявляется в крайне незначительных изменениях динамики факторов про- и антиоксидантного равновесия.
Выводы
Пластичность и дыхательных, и двигательных мышц в условиях развивающейся аллергии определяется изменением их функциональных свойств, которые затрагивают как мышечную мембрану, так и внутриклеточные механизмы ЭМС. Эти процессы в значительной степени зависят от баланса систем про- и антиоксидантного равновесия и по характеру описанных изменений существенно различаются у «смешанной» (m. diaphragma) и «быстрой» (m. EDL) мышц мыши.