Известно, что природная вода имеет в своем составе в разных соотношениях два стабильных изотопа водорода, протий и дейтерий, биологическое действие последнего на организм изучается. Подтверждено, что с изменением содержания дейтерия в организме соответственно изменяется скорость биологических реакций: скорость пpоцеccов тpанcкpипции и тpанcляции, репарационные процессы ДНК, каскадные реакции дыхательной цепи митохондрий, биосинтез [1]. Было показано [2], что вода с пониженным содержанием дейтерия не только не токсична, но и вызывает снижение степени развития лучевых повреждений у экспериментальных животных. Вместе с тем биологическое действие различных концентраций дейтерия в питьевой воде на организм все еще остается недостаточно изученным и вызывает дискуссии [3]. Изотопические эффекты в большинстве работ изучали в острых или подострых экспериментах и не учитывали макро- и микроэлементный состав вод, в которых осуществлялся сдвиг протий/дейтерий. Недостаточно изучено влияние изменения изотопного состава питьевых вод при длительном их потреблении. Поэтому целью настоящего исследования являлась гистологическая, морфофункциональная оценка в динамике действия на организм беспородных белых крыс вод с различным содержанием дейтерия в хроническом эксперименте.
Материалы и методы исследования
Исследования проводили на 175 белых нелинейных крысах (самцах). Животных содержали в условиях искусственного освещения (12 ч в сутки), постоянного доступа к стандартному комбинированному корму в клетках по 7 животных. Животные находились на свободном запаивании экспериментальными водами. Животные были разделены на 7 групп по 25 крыс в каждой в зависимости от содержания дейтериевого числа в исследованных водах, в течение 6 и 12 месяцев 1-я группа получала воду с содержанием дейтерия 10 ppm. (1 ppm = 1 part per million = 1 mg/kg = 1 mg/l), 2-я – 30 ppm., 3-я – 60 ppm., 4-я – 90 ppm., 5-я – 145 ppm., 6-я – 250 ppm., 7-я – 1000 ppm. Экспериментальные воды, использованные в исследовании, соответствовали высшей категории качества с одинаковым макро- и микроэлементным химическим составом. В качестве контрольных вод использовали воду с содержанием дейтерия 145 ppm., соответствующим концентрации дейтерия в московской водопроводной воде.
Гистологически и морфофункционально исследовались печень и почки крыс при 6- и 12-месячном потреблении питьевой воды с различными концентрациями дейтерия. Для этого после декапитации животных данные органы фиксировались в Лилли, заливались в парафин, резались на микротоме. Депарафинированные срезы окрашивались гематоксилином и эозином. В печени определялось 12 показателей [4]: число клеток РЭС (морфометрически, как среднее число на 10 полей зрения площади среза), индекс альтерации гепатоцитов (ИАГ, определяемый морфометрически как число поврежденных гепатоцитов к общему числу, в %), выраженность гемодинамических сдвигов, жировой дистрофии и диспротеинозов (гистологически, в баллах), число микронекрозов и инфильтратов (гистологически, как среднее число на 10 полей зрения площади среза), доли, занимаемые паренхимой, стромой, инфильтратами и пролифератами (стереометрически, в %), балочную дискомплексацию (гистологически, в баллах), число высокоплоидных гепатоцитов, начиная с октаплоидных ядер (морфометрически, в %). В почке исследовалось 6 показателей: индекс альтерации эпителиоцитов (ИАЭ) почечных канальцев, индекс альтерации почечных клубочков (ИАП) и число гипертрофированных почечных клубочков (ГПК), (определяемые морфометрически как число поврежденных эпителиоцитов или соответственно почечных клубочков, или гипертрофированных почечных клубочков к общему числу, в %), выраженность гемодинамических сдвигов, инфильтрирования и фиброзирования (гистологически, в баллах).
Результаты исследования и их обсуждение
В течение хронического двенадцатимесячного периода наблюдения животные имели внешний вид и поведение, соответствующее хорошему общему состоянию. Поведение и состояние животных в опытных группах заметно не отличалось от состояния в контрольной группе. Животные всех групп равномерно прибавляли в массе тела. Статистически достоверных отличий по показателю прироста массы тела в течение всего эксперимента не выявлено. Исследование морфологического состава крови животных, включающего содержание эритроцитов, гемоглобина, лейкоцитов и гематокритной величины в зависимости от состава потребляемой воды не выявило существенных гематологических сдвигов. Все величины исследованных показателей во всех группах животных находились в пределах физиологической нормы.
Сравнение морфофункционального состояния печени экспериментальных животных через 6 месяцев потребления вод с различными дозами дейтерия (табл. 1) показало, что, по сравнению с контрольной группой, где экспериментальные животные получали воду с концентрацией 145 ppm, выраженное гепатотоксическое действие наблюдалось при потреблении воды с содержанием дейтерия в 1000 ppm (7 группа).
Так, увеличивалось число инфильтратов на единицу площади среза с 0,1 до 0,25 и микронекрозов – с 0,05 до 0,34, число высокоплоидных гепатоцитов с 1,1 до 2,6, увеличен индекс альтерации гепатоцитов. Эти изменения отражают выраженный гепатотоксический эффект (Fel). Вероятно, как компенсаторная реакция достоверно возросло и число клеток ретикуло-эндотелиальной системы (РЭС) с 59,2 до 66,5. Наблюдалось увеличение индекса альтерации с 5,3 % до 18,5 % в 6 группе животных (250 ppm). Более низкие концентрации дейтерия, наоборот, оказывали на печень нормализующее действие. Так, в 1-й и 3-й группах наблюдалась тенденция к снижению ИАГ, и в 2-х группах (1-й и 4-й группах) – достоверно снижено число клеток РЭС. В группах 1 и 2 наблюдалось достоверное снижение балочной дискомплексации. При этом в группах 2 и 4 увеличен индекс альтерации гепатоцитов и достоверно увеличено число инфильтратов на единицу площади. Возможно, данные изменения в этих группах носят случайный характер, так как не просматривается закономерность в характере этих изменений и, скорее всего, она вызвана различной чувствительностью беспородных подопытных животных. Следует также отметить, что, хотя и статистически незначимо, у крыс с 1-й по 7-ю группу обнаружена мелкокапельная жировая дистрофия, отмечаемая не во всех гепатоцитах (табл. 1).
Таблица 1
Структурно-функциональные показатели печени крыс, получавших воды, содержащие различные концентрации дейтерия (6 месяцев), (М + м)
Показатели |
10 ppm (1 гр.) |
30 ppm (2 гр.) |
60 ppm (3 гр.) |
90 ppm (4 гр.) |
145 ppm (5 гр.) |
250 ppm (6 гр.) |
1000 ppm (7 гр.) |
ИАГ (в %) |
9 ± 2,6 |
11 ± 0,8* |
8 ± 1,7 |
11,6 ± 1,5* |
5,3 ± 0,8 |
9,8 ± 2,2* |
18,5 ± 5,3* |
Число клеток РЭС |
52,4 ± 1,5* |
58 ± 2,6 |
60,5 ± 5 |
51,2 ± 0,89** |
59 ± 0,4 |
60,5 ± 2,5 |
66,5 ± 1,96* |
Выраженность гемодинамических сдвигов |
0,8 ± 0,35 |
1,3 ± 0,28 |
1 ± 0 |
1 ± 0,2 |
1 ± 0 |
1 ± 0 |
1,5 ± 0,28* |
Выраженность жировой дистрофии (балл) |
0,5 ± 0,24 |
0,62 ± 0,28 |
0,37 ± 0,28 |
0,2 ± 0,11 |
0,25 ± 0,14 |
0,25 ± 0,14 |
0,37 ± 0,28 |
Выраженность диспротеинозов (балл) |
0 ± 0 |
0 ± 0 |
0 ± 0 |
0 ± 0 |
0 ± 0 |
0 ± 0 |
0 ± 0 |
Число микронекрозов на ед. площади среза |
0,08 ± 0,04 |
0,1 ± 0,05 |
0,2 ± 0,1 |
0,26 ± 0,09 |
0,05 ± 0,04 |
0,13 ± 0,11 |
0,34 ± 0,16** |
Число инфильтратов на ед. площади среза |
0,04 ± 0,02 |
0,2 ± 0,04 |
0,05 ± 0,05 |
0,2 ± 0,05 |
0,1 ± 0,02 |
0,1 ± 0,08 |
0,25 ± 0,05* |
Доля паренхимы ( %) |
95,2 ± 0,6 |
93,8 ± 1,3 |
95,5 ± 0,3 |
95,6 ± 0,6 |
95,3 ± 1,4 |
96,4 ± 0,8 |
95 ± 0,6 |
Доля стромы ( %) |
2,4 ± 0,4 |
2,8 ± 0,6 |
2,5 ± 0,3 |
2 ± 0,4 |
2 ± 0,6 |
2,3 ± 0,6 |
2,5 ± 0,3 |
Доля инфильтратов и пролифератов ( %) |
2,4 ± 0,4 |
3,4 ± 0,6 |
2 ± 0 |
2,2 ± 0,4 |
2,7 ± 0,8 |
1,3 ± 0,3 |
2,5 ± 0,3 |
Балочная дискомплексация (балл) |
0,4 ± 0,18* |
0 ± 0** |
1 ± 0,6 |
1,2 ± 0,18 |
1 ± 0,6 |
1 ± 0,6 |
1,3 ± 0,29 |
Число высокоплоидных гепатоцитов ( %) |
1,06 ± 0,32 |
0,62 ± 0,29 |
0,9 ± 0,3 |
1,7 ± 0,11 |
1,1 ± 0,5 |
1,7 ± 0,5 |
2,6 ± 0,36* |
Примечание.* – достоверность по отношению к 5-й группе, P < 0,05; ** – достоверность по отношению к 5-й группе, P < 0,001.
Таблица 2
Структурно-функциональные показатели печени крыс, получавших в течение года воды, содержащие различные концентрации дейтерия, (М + м)
Показатели |
10 ppm (1 гр.) |
30 ppm (2 гр.) |
60 ppm (3 гр.) |
90 ppm (4 гр.) |
145 ppm (5 гр.) |
250 ppm (6 гр.) |
1000 ppm (7 гр.) |
ИАГ (в %) |
16,2 ± 2,8 |
9,8 ± 0,9 |
12,3 ± 3,2 |
13,7 ± 3,9 |
10,2 ± 3 |
10,2 ± 3,5 |
17,3 ± 3,2 |
Число клеток РЭС |
57 ± 2,7 |
55,2 ± 3,7 |
58,3 ± 1,6 |
56,2 ± 2,1 |
57,3 ± 2,1 |
55,8 ± 0,9 |
59,6 ± 3,5 |
Выраженность гемодинамических сдвигов |
1,2 ± 0,35 |
1 ± 0 |
0,8 ± 0,18 |
1 ± 0,35 |
0,8 ± 0,18 |
1,2 ± 0,18 |
1,3 ± 0,18 |
Число крыс (в %) с гемодинамическим сдвигами |
100 |
100 |
83,3 |
83,3 |
83,3 |
100 |
100 |
Выраженность жировой дистрофии (балл) |
0,4 ± 0,08 |
0,7 ± 0,09 |
1 ± 0,18 |
1,4 ± 0,44 |
0,6 ± 0,08 |
1 ± 0,26 |
0,2 ± 0,09* |
Число микронекрозов на ед. площади среза |
0,3 ± 0,05 |
0,2 ± 0,05 |
0,3 ± 0,1 |
0,4 ± 0,19 |
0,3 ± 0,23 |
0,2 ± 0,09 |
0,35 ± 0,14 |
Число инфильтратов на ед. площади среза |
0,1 ± 0,07 |
0,03 ± 0,02 |
0,03 ± 0,02 |
0,18 ± 0,03 |
0,2 ± 0,1 |
0,03 ± 0,02 |
0,1 ± 0,05 |
Доля паренхимы ( %) |
95,9 ± 0,1 |
96,8 ± 0,9 |
96,8 ± 0,53 |
94,8 ± 1,2 |
95,3 ± 1,6 |
96,5 ± 0,7 |
94,3 ± 1,4 |
Доля стромы ( %) |
1,8 ± 0,53 |
1,6 ± 0,35 |
1,7 ± 0,35 |
3 ± 0,7 |
2,1 ± 0,6 |
2,1 ± 0,6 |
2,5 ± 0,53 |
Доля инфильтратов и пролифератов ( %) |
2,3 ± 0,35 |
1,6 ± 0,35 |
1,5 ± 0,18 |
2,2 ± 0,53 |
2,6 ± 0,97 |
1,4 ± 0,3 |
3,2 ± 0,9 |
Балочная дискомплексация (балл) |
1 ± 0 |
1,2 ± 0,18 |
1,3 ± 0,18 |
1,2 ± 0,35 |
1,3 ± 0,18 |
1 ± 0,35 |
1,5 ± 0,18 |
Число высокоплоидных гепатоцитов ( %) |
1,1 ± 0,32 |
1,4 ± 0,3 |
1,4 ± 0,23 |
1,5 ± 0,37 |
0,9 ± 0,1 |
1 ± 0,07 |
1,8 ± 0,19* |
Примечание.* – достоверность по отношению к 5-й группе, P < 0,05.
Результаты гистологического исследования печени на 12-м месяце эксперимента показали (табл. 2), что у крыс, получавших воды с различным содержанием дейтерия, отмечены изменения 2-х показателей, достоверно отличающиеся при водопотреблении воды с содержанием дейтерия 1000 ppm (число высокоплоидных гепатоцитов и выраженность жировой дистрофии).
Так достоверно минимально выраженная жировая дистрофия (0,2 балла) у группы экспериментальных животных при потреблении воды с содержанием дейтерия в 1000 ppm объясняется тем, что развившаяся полиплоидия гепатоцитов при высоком содержании дейтерия заменила поврежденные жировой дистрофией клетки. Вместе с тем жировая дистрофия достоверно устойчиво повышена в группах животных, потреблявших воду с 30 по 250 ppm.
По сравнению с контрольной 5-й группой в 7 группе животных, потреблявших воду с 1000 ppm, достоверно повышены гемодинамические сдвиги и число высокоплоидных гепатоцитов. Так как показано, что повышение числа высокоплоидных гепатоцитов указывает на выраженное вредное действие (Н.Н. Беляева, 1997, 2002), то в данном эксперименте гепатотоксический эффект у крыс проявляется только при потреблении воды, содержащий 1000 ppm дейтерия. У животных 7-й группы достоверно увеличено число высокоплоидных гепатоцитов, что еще раз подтверждает, что содержание в воде дейтерия в 1000 ppm приводит к явно выраженному гепатотоксическому эффекту. Таким образом, выраженное патологическое действие на печень отмечено для воды с содержанием дейтерия на уровне 1000 ppm. А если учитывать минимальное число крыс с гемодинамическими сдвигами, то оптимальное содержание дейтерия в воде установлено в диапазоне
60–145 ppm.
Результаты исследований по оценке влияния различных концентраций дейтерия в воде на морфофункциональные показатели почек животных представлены в табл. 3, 4. Их сравнение, так же как и для показателей печени, проведено с 5-й группой, то есть с животными, потребляющими воду с естественным содержанием дейтерия (145 ppm).
Таблица 3
Структурно-функциональные показатели почек животных, получавших воды с различным содержанием дейтерия (6 месяцев), (М + м)
Показатели |
10 ppm (1 гр.) |
30 ppm (2 гр.) |
60 ppm (3 гр.) |
90 ppm (4 гр.) |
145 ppm (5 гр.) |
250 ppm (6 гр.) |
1000 ppm (7 гр.) |
ИА ядер эпителиоцитов почечных канальцев (в %) |
8,4 ± ,4 |
14,6 ± 4,9 |
9,2 ± 1,1 |
13,2 ± 2,4* |
6 ± 0,8 |
8,6 ± 1,29 |
18 ± 5,6* |
ИА почечных клубочков (в %) |
3 ± 0,4 |
3,2 ± 0,2 |
3,4 ± 0,4 |
2,8 ± 0,4 |
2,4 ± 0,2 |
6,8 ± 1,5* |
6,5 ± 0,5* |
Число гипертрофированных почечных клубочков (в %) |
5,6 ± 1,5 |
7,6 ± 0,86 |
11,4 ± 1,9 |
8,4 ± 1,1 |
4,6 ± 2,9 |
8,8 ± 1,59 |
8,8 ± 1,1 |
Выраженность гемодинамических сдвигов (в баллах) |
1,2 ± 0,2 |
1,4 ± 0,2 |
1 ± 0 |
1,4 ± 0,2 |
1 ± 0 |
1 ± 0 |
1,5 ± 0,28 |
Число микро-некрозов на ед. площади среза |
0,14 ± 0,1 |
0,04 ± 0,04 |
0 ± 0 |
0,04 ± 0,04 |
0 ± 0 |
0 ± 0 |
0,1 ± 0,04 |
Выраженность инфильтрирования и фиброзирования (в баллах) |
1,2 ± 0,2 |
1,6 ± 0,4 |
1 ± 0 |
1,4 ± 0,2 |
1,4 ± 0,2 |
1 ± 0 |
1,5 ± 0,28 |
Примечание.* – достоверность различий к 5-й группе, P < 0,05.
Таблица 4
Структурно-функциональные показатели почек крыс после годового потребления вод, содержащих различные концентрации дейтерия, (М + м)
Показатели |
10 ppm (1 гр.) |
30 ppm (2 гр.) |
60 ppm (3 гр.) |
90 ppm (4 гр.) |
145 ppm (5 гр.) |
250 ppm (6 гр.) |
1000 ppm (7 гр.) |
ИА ядер эпителиоцитов почечных канальцев (в %) |
15,7 ± 1,4 |
13,3 ± 2,1 |
10,3 ± 1,4 |
8,8 ± 0,9 |
12,2 ± 3,4 |
20,3 ± 1,6** |
22 ± 3,7* |
ИА почечных клубочков (в %) |
10,3 ± 0,9* |
6,5 ± 1,4 |
3,8 ± 0,4* |
2,2 ± 0,4* |
6 ± 0,9 |
9,3 ± 1,7 |
7 ± 1,9 |
Число гипертрофирован-ных почечных клубочков (в %) |
10,3 ± 1,1 |
3,8 ± 0,53 |
4,8 ± 1,1 |
4 ± 1,1 |
7,8 ± 1,4 |
7,5 ± 0,7 |
6 ± 0,7 |
Выраженность гемодинамических сдвигов (в баллах) |
1,7 ± 0,2 |
1,5 ± 0,2 |
1,2 ± 0,2 |
1,2 ± 0,2 |
1,7 ± 0,2 |
1,3 ± 0,2 |
2 ± 0,4 |
Число микро-некрозов на ед. площади среза |
0,11 ± 0,05 |
0,05 ± 0,01 |
0,08 ± 0,05 |
0,03 ± 0,03 |
0,08 ± 0,03 |
0,08 ± 0,03 |
0,16 ± 0,08 |
Выраженность инфильтрирования и фиброзирования (в баллах) |
1,3 ± 0,2 |
1,8 ± 0,4 |
1,5 ± 0,18 |
1 ± 0 |
1,7 ± 0,2 |
1 ± 0,2 |
1 ± 0 |
Примечание. *– достоверность по отношению к 5-й группе, P < 0,05; **– достоверность по отношению к 5-й группе, P < 0,001.
При сравнении структурно-функциональных показателей состояния почек экспериментальных животных, получавших воду с низким и повышенным содержанием дейтерия, с группой получавших воду с природным содержанием дейтерия (5-я группа) отмечено ухудшение исследованных показателей у животных 7-й группы, характеризующееся достоверным повышением индекса альтерации (ИА) ядер почечных канальцев и ИА почечных клубочков. У животных, потреблявших воду с концентрацией дейтерия 250 ppm, так же достоверно повышался индекс альтерации почечных клубочков. Однако концентрация дейтерия на уровне 90 ppm тоже вызвала достоверные изменения – повышение ИА ядер эпителиоцитов почечных канальцев.
Сравнение состояния почек животных, после годового потребления вод с различным содержанием дейтерия, с аналогичными показателями у животных 5-й группы (табл. 4) показало, что достоверно повышается индекс альтерации (ИА) ядер почечных канальцев в группе животных, потреблявших воду с концентрацией дейтерия 250 ppm и 1000 ppm. Также при содержании дейтерия в воде на уровне 10 ppm развивается достоверное повышение ИА почечных клубочков, что отличается от результатов полученных другими авторами [5, 6], подчеркивающими, что вода с пониженным содержанием дейтерия не оказывает в физиологических условиях токсического действия на организм лабораторных животных. Но существуют также и работы [7], где безопасность постоянного применения легкой воды ставится под сомнение.
В группах животных, получавших воду с содержанием дейтерия в воде в 60 и 90 ppm, отмечено наименьшее повреждение по показателю ИА почечных клубочков. По всей видимости данное содержание дейтерия является для почек оптимальным, так как в этих группах ИА почечных клубочков является достоверно минимальным даже по отношению к контрольной группе.
Заключение
Таким образом, на основании полученных в результате двенадцатимесячного хронического эксперимента статистических данных гистологической и структурно-функциональной оценки печени и почек нелинейных белых крыс, употребляющих воды с содержанием дейтерия от 10 до 1000 ppm, выявлено выраженное патологическое воздействие на структурно-функциональные показатели обоих исследованных органов при потреблении вод с повышенным содержанием дейтерия (250 и 1000 ppm). Воды с очень низким содержанием дейтерия, на уровне 10–30 ppm, вызывали у нелинейных крыс менее выраженные изменения в структурно-функциональных показателях органов. Содержание дейтерия в питьевой воде на уровне 60–90 ppm оказывало оптимизирующее воздействие на показатели состояния почек экспериментальных животных.